Введение. Разработка диагностики гестационных осложнений, связанных с дисфункцией эндотелия, поиск новых методов раннего выявления нарушений сосудистого гомеостаза являются актуальнейшей задачей современной медицины. Вопросы раннего выявления нарушений адаптации и инициирования патологических механизмов, вызывающих дестабилизацию сосудистого тонуса, остаются на сегодняшний день решающими в профилактике акушерской и перинатальной патологии [1]. Поиск диагностических маркеров эндотелиальных дисфункций является одним из важнейших направлений в снижении общей заболеваемости, в том числе акушерской патологии и перинатальных потерь. Исследованием нарушений микроциркуляторного русла ученые занимаются длительное время, и в арсенале сегодня существует большое количество методов [2]. В настоящее время все методы, применяемые для диагностики патологии эндотелиальной системы можно разделить на 3 группы, в зависимости от точек приложения диагностического поиска:
- Функциональная диагностика - оценка реактивности эндотелиальной системы на различные раздражители, которая проявляется изменениями физических показателей сосудистой системы.
- Биохимическая диагностика - выявление биологически активных веществ, продуцируемых эндотелиоцитами, концентрация которых в периферической крови маркирует функциональное состояние эндотелиальной системы.
- Цитологическая диагностика - оценка количества циркулирующих десквамированных эндотелиальных клеток в периферической крови с помощью методов микроскопии.
Следует отметить, что большинство методов диагностики эндотелиальной дисфункции опосредованы, т.к. оценивают уровень медиаторов, продуцируемых эндотелием или участвующих в работе эндотелиальной системы, или определяют неспецифическую реакцию на повреждение и активацию эндотелия при патологических состояниях. Функциональная диагностика, обладая неоспоримыми достоинствами, несколько ограничена в применении необходимостью наличия дорогостоящей ультразвуковой аппаратуры и высококвалифицированных специалистов. Кроме того эти методики редко используются в акушерстве. Микроциркуляторное русло во время беременности претерпевает изменения, что требует коррекции при интерпретации результатов исследования. Кроме того, введение вазоактивных препаратов функциональной диагностики не всегда допустимо при беременности, т.к. связано с возможностью негативного влияния на плод.
Диагностика биохимических маркеров также имеет ограничения. Оценка функции эндотелия осуществляется сегодня по концентрации в сыворотке крови оксида азота NO - прямого маркера функции эндотелия. Однако молекула оксида азота не стабильна, и концентрация её в крови сильно варьирует в течение короткого промежутка времени. Остальные же биохимические маркеры (эндотелин-1, фактор фон Виллебранда, тромбоксан и т.д.) дают косвенную оценку состояния эндотелия, так как могут сопровождать течение многих других сосудистых, обменно-эндокринных или коагулогических заболеваний, а при беременности изменяют свою концентрацию и в физиологических условиях. Большая часть этих веществ синтезируется не только в эндотелиоцитах, но и в других клетках организма, что ограничивает их диагностическую ценность. Интерпретация большинства биохимических маркеров эндотелиальной дисфункции требует учета сопутствующей патологии, что снижает точность и объективность используемых методик.
Диагностика, основанная на оценке морфологии клеток эндотелия, представляется перспективным направлением изучения системной эндотелиопатии. Эндотелиоциты - очень лабильные биологические структуры, и морфологические изменения этих клеток могут являться объективным критерием повреждения эндотелиальной системы. Современные компьютерные технологии позволяют выявлять мельчайшие изменения в структуре биологического объекта, маркируя самые ранние, доклинические стадии патологического процесса. Цитологическая диагностика эндотелиальной дисфункции основана на подсчете циркулирующих десквамированных эндотелиоцитов в периферической крови [3]. Циркулирующие десквамированные эндотелиоциты - это клетки, которые отделяются от стенки сосуда в процессе его повреждения, и являются прямым клеточным маркером дисфункции эндотелия [4, 5]. Концентрация десквамированных эндотелиоцитов в периферической крови в норме очень мала, так как процесс самообновления эндотелия происходит медленно, и десквамированные клетки интенсивно поглощаются в кровотоке системой макрофагов [6]. В то же время, отмечено увеличение количества этих клеток при различных патологических состояниях, сопряженных с поражением сосудистой системы (васклиты, сердечно-сосудистые заболевания, злокачественные новообразования и т.п.) [4, 7]. Основываясь на этом факте, можно утверждать, что уровень десквамированных эндотелиоцитов в периферической крови является отражением системного поражения эндотелия [6].
Впервые десквамированные эндотелиоциты в периферической крови изучил в 1978 г. J.Hladovec, который обнаружил феномен так называемой эндотелиемии у крыс после введения им вазоактивных препаратов [3]. Микросокпически эндотелиальные клетки представляют плоские структуры толщиной 1-2 мкм и диаметром 10-50 мкм и обладают выраженной морфологической неоднородностью [8]. При десквамации эндотелиоциты фиксируются при микросокпии как в неизмененном виде, так и в виде клеточных фрагментов - так называемых, апоптических телец. [5]. Доказано, что поражение эндотелиальных клеток сопряжено с апоптозом. Морфологическая картина апоптоза представляется как сморщивание цитоплазмы, уменьшение объема клетки, конденсация и последующий распад ядра на части, фрагментация клетки на мембранные везикулы с внутриклеточным содержимым - апоптозные тельца [9]. В нашем исследовании разработан новый подход в цитодиагностике эндотелиальной дисфункции у беременной, основанный на анализе морфологии десквамированного эндотелиоцита с помощью метода компьютерной цитометрии. В основе новой диагностики лежит ключевой момент повреждения эндотелиальных клеток - апоптоз. Произведенный компьютерный анализ изображения десквамированных эндотелиоцитов позволил получить качественную и количественную характеристику изменений в клетке, сигнализирующих о нарушении гомеостаза эндотелиальной системы. Эндотелиальная дисфункция у беременных сопровождается изменениями в фетоплацентарном комплексе, что имеет принципиальную важность в развитии перинатальной патологии. Выявление доклинических форм поражения сосудистой системы во время беременности важно, как для понимания патогенеза фетоплацентарной недостаточности, так и для разработки новых методов доклинической диагностики осложнений течения беременности и перинатальных исходов.
Цель исследования: разработка ранней диагностики нарушений эндотелиальной системы во время беременности с помощью цитометрического исследования десквамированных эндотелиоцитов периферической крови.
Пациенты и методы. Для выполнения поставленной цели нами была обследована 51 беременная. Исследуемый контингент был разделен на 2 группы. Контрольную группу составили 18 здоровых женщин с нормально протекающей беременностью. В основную группу вошли 33 беременных, у которых была диагностирована неразвивающаяся беременность в первом триместре. У всех беременных проводились все регламентированные лабораторные и инструментальные исследования. Дополнительно с целью диагностики состояния эндотелия проводилось исследование ряда биохимических маркеров эндотелиальной дисфункции сыворотки крови и мочи.
Микроальбуминурия является показателем нарушения фильтрации в почках. При поражении эндотелия в моче появляются следы белка, которые расценивают, как один из ранних прогностических критериев поражения эндотелиальной системы. Количественное определение альбумина в образцах мочи проводили с помощью иммуноферментного анализа.
Фактор фон Виллебранда - сложный гликопротеин, синтезируемый эндотелиальными клетками, который, участвуя в процессах коагуляции, в то же время является маркером эндотелиальной дисфункции. Определение фактора фон Виллебранда осуществлялось количественным методом иммуноферментного анализа.
Белок р53 - это транскрипционный фактор, регулирующий клеточный цикл. Белок р53 реагирует на поломки в молекуле ДНК клетки, активируется и запускает механизм апоптоза. При отсутствии повреждений генетического аппарата белок р53 находится в неактивном состоянии, а при появлении повреждений ДНК белок р53 переходит в активную форму, и его концентрация в сыворотке крови возрастает. Показатели концентрации белка р53 дают характеристику активности процессов апоптоза в организме. Количественное определение белка р53 в сыворотке крови осуществлялось методом иммуноферментного анализа.
У всех пациентов было проведен подсчет десквамированных эндотелиальных клеток в периферической крови по методике, предложенной в 1978 г. J. Hladovec [3]. Методика основана на визуальной оценке пораженных клеток путем фазово-контрастной микроскопии. Венозная кровь в объеме 4-5 мл стабилизируется 3,8% раствором цитрата натрия и центрифугируется (1000 оборотов, 10 минут). Тромбоцитарная масса сепарируется путем добавления раствора АДФ и центрифугирования (1000 оборотов, 10-15 минут). Полученная надосадочная жидкость сливается, к осадку добавляется 0,1 мл 0,9% физиологического раствора. Определение количества клеток эндотелия осуществляется камере Горяева с последующим пересчетом на 100 мл плазмы с учетом изменения концентрации в процессе проведения вышеописанной методики. У всех беременных произведена компьютерная цитометрия десквамированных эндотелиоцитов периферической крови. Цитологические препараты исследовали под микросокпом Leika DM 1000 с компьютерной видеоприставкой для обработки и анализа изображений Leika Application Suite LAZ EZ Version 2.1.0. (2012). Исследовались следующие цитометрические параметры десквамированных эндотелиоцитов: средний диаметр клетки, средний периметр клетки, средняя площадь клетки, фактор формы, поляризация клетки.
Статистическая обработка материала осуществлялась с помощью программ Excel (Microsoft Office Excel 2003) и Statistica (for Windows release 6.0 компании StatSoft.Inc., 2002). Были определены средняя арифметическая величина (М), ошибка средней арифметической (м), отклонение варианты (v). Производилось вычисление критерия Стьюдента (t) и достоверность двух средних величин (р). В исследовании учитывались только достоверные корреляционные связи (р<0,05). Вероятностные связи между полученными параметрами эндотелиоцитов у матери и плода определялись построением двумерной нормально распределенной генеральной совокупности. Корреляция оценивалась с помощью индекса Пирсона (R).
Результаты исследования и их обсуждение. Возраст беременных составил от 20 до 43 лет. Индекс массы тела в основной группе имел средний показатель 24,34 кг/м2. При этом беременные с избыточной массой тела составили 30,3% (10 чел.). Средний показатель индекса массы тела в контрольной группе составил 23,18 кг/м2. Ожирением страдали в этой группе 4 человека (22,2%). Следует отметить, что в основной группе чаще встречались беременные с ожирением 2 степени (3 человек, 9,1%). В контрольной же группе ожирение 2 степени выявлено только у 1 беременной (5,6%). При изучении занятости исследуемых беременных выявлено, что в основной группе работало и училось 21 человек (63,6%). При этом малоактивный образ жизни был у 17 женщин (51,5%). В контрольной группе было 7 женщин занятых на работе или учебе (38%). При этом малоактивный образ жизни встречался в этой группе только у 1 женщины (5,6%). При исследовании вредных привычек следует выделить никотиновую зависимость. В контрольной группе этот показатель составил 38,9% (7 чел.). В основной же группе курили 15,2% беременных (5 чел.).
С дисфункцией эндотелия ассоциируются все основные сердечно-сосудистые факторы риска: курение, ожирение, гиперхолестеринемия, артериальная гипертензия и сахарный диабет. При заболеваниях, сопряженных с атеросклеротическим поражением сосудов, эндотелий представляет орган-мишень, поскольку эндотелиальная выстилка сосудов участвует в регуляции сосудистого тонуса и гемостаза [10]. Таким образом, гиподинамия, курение, ожирение - факторы риска эндотелиальной дисфункции - имели статистические отличия в исследованных группах.
Изучение экстрагенитальной патологии у исследуемого контингента не показало статистических различий в исследуемых группах. Заболевания желудочно-кишечного тракта в стадии компенсации встречались у 6% беременных основной группы (2 чел.) и у 5,6% контрольной группы (1 чел.). Заболевания мочевыделительной системы - у 4 чел. основной группы (12,1%), и у 2 человек контрольной группы (11,1%). Заболевания щитовидной железы выявлены у 6,1% женщин основной группы (2 чел.), и у 5,6% (1 чел.) контрольной группы. Все выявленные заболевания были в стадии ремиссии на момент обследования. Сахарный диабет и гипертоническая болезнь являются самостоятельными предикторами поражения эндотелиальной системы, поэтому были критериями исключения в дизайне исследования.
При определении показателя среднего количества десквамированных эндотелиоцитов в исследуемых группах отмечено повышение почти в два раза в группе беременных с неразвивающейся беременностью: 11,8±6,19 х104 клеток/100мл в основной группе и 6,06±3,41 х104 клеток/100мл - в контрольной группе (p≤0,001; t=4,29).
Помимо общепринятой методики подсчета десквамированных эндотелиоцитов периферической крови, разработанной J. Hladovec (1978), нами использован метод качественной оценки десквамированных эндотелиоцитов, позволяющий получить больший объем информации о состоянии эндотелия человека. В процессе поражения клетка проходит стадии сжатия, конденсации хроматина и формирования апоптозных телец. При этом изменяется геометрия пораженной клетки. При выраженной степени эндотелиальной дисфункции большая часть десквамированных эндотелиоцитов фиксируется при цитоморфометрии в стадии блеббинга и апоптозных телец, что отражается в уменьшении геометрических параметров измененных клеток (рис 1-3).
Рис. 1. Десквамированные эндотелиоциты в камере Горяева. Окраска метиленовый синий. Увеличение СМ Х600.
При цитометрическом исследовании десквамированных эндотелиоцитов периферической крови получены следующие результаты в исследуемых группах. Диаметр - расстояние между максимально удаленными точками (пикселами) изображения на плоскости. Средний диаметр десквамированных эндотелиоцитов контрольной группы составил 43,93±4,067 мкм, что в 1,5 раза выше данного показателя основной группы 29,47±9,46 мкм (p≤0,001, t=6,44).
Периметр - сумма пикселов, выполняющих линию границы клетки. В процессе апоптоза форма клетки изменяется, проходя стадии сжатия, дробления и формирования апоптозных телец. Характеристика изменения периметра клетки может являться дополнительным цитометрическим показателем активности апоптоза эндотелиоцита. Средний периметр десквамированных эндотелиоцитов в контрольной группе составил 139,64±14,26 мкм, в основной группе - 93,83±29,9 мкм (p≤0,05, t=3,03).
Площадь объекта - это количество пикселов изображения, которое принимается за клетку. Учитывается количество пикселов, не выходящих за границу объекта. На величину параметра влияют реальные размеры клетки и способность образовывать выросты. Средняя площадь десквамированного эндотелиоцита составила в контрольной группе 1546,7±297,47 мкм² и 842±484,44 мкм² - в основной группе (p≤0,001, t=4,64).
Фактор формы - характеристика изрезанности периметра оптического объекта, безразмерная величина, представляющая комбинацию характеристик размеров и формы частицы или структурной составляющей, представляющей отношение длины к ширине или квадрата периметра к плоскости. Фактор формы круга составляет 12,56. Данный показатель цитометрического исследования показывает приближение формы объекта к форме круга. Фактор формы десквамированных эндотелиоцитов периферической крови составил 12,73±0,12 в контрольной группе, 11,27±0,77 - в основной (p>0,05, t=0,29).
Поляризация - степень эллиптичности объекта. Этот параметр изменяется от 0 до 2. Изменение формы десквамированного эндотелиоцитва сопряжено с потерей округлой формы клетки. Показатель поляризации может быть использован как дополнительный параметр цитометрической характеристики деквамированной эндотелиальной клетки. Поляризация десквамированных эндотелиоцитов: 0,083±0,024 в контрольной группе, 0,14±0,053 в основной группе (p≤0,001, t=7,04). Таким образом, большинство цитометрических показателей десквамированнх эндотелиоцитов периферической крови имело отличие в исследуемых группах. Полученные результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1. Параметры десквамированных эндотелиоцитов периферической крови в исследуемых группах
Примечания: здесь и далее * - p≤0,05 (достоверность различий установлена по отношению к контрольной группе), ** - p≤0,001 (достоверность различий установлена по отношению к контрольной группе).
С целью верификации цитометрических маркеров поражения эндотелия у беременных произведено определение показателей сыворотки крови и мочи, характеризующих функцию эндотелия. Результаты исследования биохимических маркеров поражения эндотелия представлены в табл. 2.
Все показатели, как и ожидалось, в основной группе превышали аналогичные результаты контрольной группы. Так, показатель микроальбуминурии был более чем в 2 раза выше в основной группе: 0,023±0,009 мкг/мл в основной группе и 0,009±0,011 мкг/мл в контрольногй группе (p≤0,05, t=1,41). Средний показатель фактора фон Виллебранда также превышал в основной группе соответствующий результат у беременных контрольной группы: 120,33±19,38% и 103,47±4,41% соответственно (p≤0,05, t=0,18). Маркер апоптоза белок р53 сыворотки крови в основной группе превышал показатель контрольной группы почти в 3 раза: 0,011±0,018 Ед/мл в основной группе и 0,003±0,0021 Ед/мл в контрольной группе (p≤0,05, t=1,18). Таким образом, исследование биохимических маркеров эндотелиальной дисфункции подтвердило достоверность изменений цитометрических показателей десквамированных эндотелиоцитов в периферической крови.
Таблица 2. Сравнительная характеристика биохимических маркеров функции эндотелия
Произведен корреляционный анализ зависимости количества десквамированных эндотелиоцитов и среднего диаметра десквамированных эндотелиоцитов. Построена модель двумерной нормально распределенной генеральной совокупности. Диаграмма рассеивания параметров цитометрических параметров десквамированных эндотелиоцитов периферической крови представлена на рис. 2.
Были изучены вероятностные связи между биохимическими маркерами эндотелиальной дисфункции и геометрическими параметрами десквамированных эндотелиоцитов периферической крови. Диаграммы корреляционных отношений среднего диаметра десквамированных эндотелиоцитов периферической крови и концентрацией фактора фон Виллебранда, альбумина и белка апоптоза р53 представлены на рис. 3-5. Корреляция определялась с помощью индекса Пирсона.
Полученные результаты показали наиболее тесную корреляционную связь геометрических параметров десквамированных эндотелиоцитов с количеством десквамированных эндотелиоцитов периферической крови. Также высокий индекс Пирсона выявлен в анализе корреляции среднего диаметра эндотелиоцитов и белка апоптоза р53. Поражение эндотелиоцитов сопряжено с апоптозом, что проявляется изменением геометрических параметров клетки. Вероятно, выявленные изменения цитометрических показателей десквамированных эндотелиоцитов в исследуемых группах объясняются активностью процессов апоптоза в пораженных клетках, о чем свидетельствует и изменение параметра белка апоптоза р53. Фиксация десквамированных эндотелиоцитов в различных стадиях апоптоза отражается на показателях геометрии десквамированных эндотелиоцитов, что может являться информативным критерием оценки нарушения эндотелиальной системы.
Рис. 2. Диаграмма линейной корреляции количества и среднего диаметра десквамированных эндотелиоцитов.
Рис. 3. Диаграмма линейной корреляции фактора Виллебранда и среднего диаметра десквамированных эндотелиоцитов.
Рис. 4. Диаграмма линейной корреляции микроальбуминурии и среднего диаметра десквамированных эндотелиоцитов.
Рис. 5. Диаграмма линейной корреляции концентрации р53 и среднего диаметра десквамированных эндотелиоцитов.
Заключение. Предложенный цитометрический метод диагностики позволяет проводить непосредственный анализ состояния эндотелиальных клеток, что наиболее достоверно отражает степень повреждения эндотелиальной системы. Десквамация эндотелиальных клеток - маркер необратимых изменений в эндотелии, и метод, позволяющий определить степень этих изменений, может являться объективным критерием поражения эндотелиальной системы. Перспективным представляется морфологическое изучение циркулирующих десквамированных эндотелиоцитов, метод качественной оценки эндотелиальных клеток, позволяющий получить больший объем информации о состоянии эндотелиальной системы. Современные технологии направлены на повышение точности измерений, объективизацию получаемых результатов, что определяет комплексный подход к решению поставленных дифференциально-диагностических задач на основе количественного и качественного анализа особенностей циркулирующих десквамированных эндотелиоцитов. Морфометрия циркулирующих десквамированных эндотелиоцитов может являться перспективным направлением ранней диагностики нарушения эндотелиальной системы у человека. Разработанный метод цитометрии десквамированнных эндотелиоцитов повышает информативность оценки нарушений эндотелиальной системы, позволяет оптимизировать раннюю диагностику сосудистых нарушений, профилактировать развитие гестационных и перинатальных осложнений.