Введение. Известно, что ингаляции газового потока, исходно содержащего синглетный кислород, рядом отечественных и зарубежных исследователей воспринимаются как средство реабилитации, способствующее повышению адаптивных возможностей организма в спортивной медицине и лечении ряда заболеваний терапевтического профиля [1-3]. В то же время системные и молекулярно-клеточные механизмы его действия до сих пор изучены достаточно слабо [2, 4]. В связи с этим нами проводятся систематические исследования, направленные на верификацию и расшифровку эффектов и механизмов влияния синглетного кислорода на биологические системы в физиологических и патологических условиях. Так, на образцах крови человека показано, что ее обработка синглетным кислородом способствует стимуляции антиоксидантных систем, энергетического метаболизма эритроцитов, оптимизации параметров кислотно-щелочного равновесия [4]. У здоровых животных десятидневный курс ингаляций синглетного кислорода также вызывал антиоксидантный эффект и активацию энергетического обмена в крови и тканях [5]. Продемонстрировано и влияние рассматриваемого воздействия на кристаллогенные свойства сыворотки крови, реализующееся в форме структуризации как в условиях in vitro, так и in vivo (на крысах линии Вистар) [6].
При моделировании тяжелой системной патологии (на примере термической травмы) также установлены положительные метаболические эффекты синглетного кислорода, тогда как влияние на дегидратационную структуризацию сыворотки крови не изучено.
В связи с этим целью исследования явилось изучение динамики кристаллогенных свойств сыворотки крови крыс при проведении курса ингаляций синглетного кислорода в послеожоговом периоде.
Материал и методы исследования. Эксперимент был выполнен на 30 половозрелых крысах линии Вистар, разделенных случайным образом на две равные по численности группы. Первая группа (n=10) была интактной, животным, включенным в нее, не проводили никаких манипуляций, а производили лишь однократное получение крови из подъязычной вены.
Животным 2 (контрольной) и 3 (основной) групп под комбинированным наркозом («Золетил» + «Ксила») наносили термическую травму по собственной методике, осуществляли стандартное местное лечение [7]. Начиная со следующего за нанесением травмы дня, крысам основной группы в течение 10 дней ежедневно проводили ингаляции воздушного потока, поступающего от генератора синглетного кислорода. Для создания газовой смеси, включающей синглетный кислород, использовали аппарат «Airnergy Professional Plus» (Германия) [3]. Продолжительность каждой процедуры составила 10 минут. Мощность генератора – 100%. На следующий день после завершения полного курса ингаляций у крыс данной группы из подъязычной вены производили получение образцов крови для исследования. В аналогичные сроки забирали кровь и у животных 2 группы.
Для получения сыворотки крови производили центрифугирование всех образцов при 1500 об/мин в течение 15 мин. Затем сыворотку крови в объеме 100 мкл. наносили на предметное стекло и приготавливали микропрепараты высушенной биологической жидкости в соответствии с методами кристаллоскопии и сравнительной тезиграфии [6, 8]. В качестве базисного вещества в тезиграфическом тесте использовали 0,9% раствор хлорида натрия.
Высушенные микропрепараты оценивали морфологически (путем описания особенностей структуризации высушенного образца биологической жидкости) [8-11] и визуаметрически (с применением собственной системы параметров) [6]. Основными визуаметрическими показателями, оцениваемыми в балльной шкале, служили кристаллизуемость (отражает количественную сторону кристаллизации – плотность кристаллических элементов в фации), индекс структурности (характеризует сложность структуропостроения), степень деструкции фации (представляет собой индикатор качественной стороны процесса – правильности образования структур) и выраженность краевой зоны микропрепарата. Для критериального описания тезиграмм использовали тезиграфический индекс (отражает инициаторный потенциал по отношению к базисному веществу), кристалличность (аналогична индексу структурности), степень деструкции фации и выраженность краевой зоны.
Результаты морфологической и визуаметрической оценки микропрепаратов сыворотки крови дополнительно верифицировали с применением спектроскопического исследования фаций. Анализ оптических свойств сформированных кристаллоскопических и тезиграфических образцов осуществляли с использованием планшетного спектрофотометра PowerWave XS (США) при длинах волны 300, 350 и 400 нм. Коррекцию уровня оптической плотности микропрепаратов проводили путем вычитания из полученного значения оптической плотности пустого стекла (регистрацию производили дополнительно на участке каждого предметного стекла, не содержащем дегидратированных капель биологической жидкости).
Статистическая обработка результатов произведена с помощью лицензионной программы Statistica 6.1 for Windows. Уровень статистической значимости различий определяли по t-критерию Стъюдента.
Результаты и обсуждение. Сопоставление кристаллоскопических картин сыворотки крови крыс интактной и контрольной групп позволило подтвердить ранее показанные закономерности трансформации дегидратационной структуризации биожидкости, ассоциированные с термической травмой [12].
Они проявляются в выраженном угнетении кристаллогенной активности биосреды, упрощении состава элементов и резком нарастании количества и степени разрушения деструктированных элементов, о чем свидетельствуют сдвиги уровней кристаллизуемости, индекса структурности и степени деструкции фации соответственно. При этом размер краевой зоны микропрепарата у обожженных животных был существенно снижен, что реализуется в изменении соответствующего морфометрического показателя.
Указанные тенденции изменения характера кристаллогенной активности сыворотки крови животных полностью согласуются с результатами параметрической оценки этих фаций (рис. 1). Так, о выраженном ингибировании кристаллизации биологической жидкости свидетельствует резкое падение уровня кристаллизуемости и индекса структурности у крыс с термической травмой по сравнению с интактными животными (p<0,05 для обоих показателей). На этом фоне нарушаются процессы структуропострения в высыхающих образцах биосреды, о чем наглядно свидетельствует существенное нарастание степени деструкции фации кристаллогенеза (p<0,05 по отношению к здоровым крысам)– основного критерия «правильности» [6]. Формирующиеся у обожженных животных гипопротеинемия и диспротеинемия находят отражение в уменьшении относительной ширины краевой зоны (p<0,05), содержащей белки нативной структуры и оцениваемой по уровню параметра Кз [9, 10, 13-15].
Рис. 1. Результаты оценки кристаллограмм сыворотки крови крыс сформированных групп (ТТ – термическая травма, СК - ингаляции синглетного кислорода, ИС – индекс структурности, Кр - кристаллизуемость, СДФ – степень деструкции фации, Кз – выраженность краевой зоны).
Проведение курса ингаляционной терапии существенно снижает выраженность патологических сдвигов кристаллогенных свойств сыворотки крови крыс (рис. 1). Следует подчеркнуть, что изучаемое воздействие способствовало нормализации всех основных оценочных показателей кристаллоскопического теста, причем они статистически значимо отличались как от уровня, характерного для крыс с термической травмой, так и от здоровых животных (p<0,05 для всех случаев). Это косвенно указывает на реадаптивные возможности тестируемого метода метаболической коррекции нарушений, имеющих место в послеожоговом периоде.
Аналогичный характер изменений фиксировали при анализе результатов сокристаллизации сыворотки крови животных с базисным веществом, оцениваемых в тезиграфическом тесте (рис. 2). В этом случае у получивших термическую травму крыс также наблюдали выраженное угнетение инициаторных свойств биосреды по сравнению с интактными животных, о чем свидетельствовало существенное снижение уровня тезиграфического индекса и кристалличности фаций (p<0,05 для обоих показателей). Кроме того, присутствовало у нарастание степени деструкции элементов образца в сочетании с уменьшением размера краевой зоны микропрепарата (p<0,05 по отношению к здоровым крысам).
Рис. 2. Результаты оценки тезиграмм сыворотки крови крыс сформированных групп (базисное вещество – 0,9% раствор хлорида натрия; ТИ – тезиграфический индекс, К - кристалличность; остальные сокращения – как на рис. 1).
Критериальная оценка тезиграмм сыворотки крови животных основной группы, получивших после нанесения термической травмы крыс ингаляций синглетного кислорода, полностью соответствовала результатам кристаллоскопического исследования, т. к. по всем главным показателям отмечали статистически значимое приближение к значениям, характерным для интактной группы. Наиболее выраженной указанная тенденция была в отношении кристалличности образцов и выраженности краевой зоны, что может косвенно свидетельствовать о снижении степени тяжести присутствующей у животных эндогенной интоксикации, а также существенной нормализации белкового профиля крови. Следует подчеркнуть, что второй из приведенных параметров после курса ингаляций синглетного кислорода обнаруживался лишь незначимо сниженным по сравнению со здоровыми животными (p<0,1). При этом высокая выраженность дизметаболических сдвигов, индуцированных нанесенной крысам сочетанной термической травмы, способствовала сохранению в значительной степени сниженного уровня тезиграфического индекса, а также умеренной тенденции к оптимизации степени деструкции фаций после проведенного курса лечения, дополненного ингаляционным применением синглетно-кислородной газовой смеси.
В целом, данные морфологической и визуаметрической оценки кристаллограмм и тезиграмм сыворотки крови крыс указывают на позитивное влияние ингаляций синглетного кислорода на эти физико-химические показатели.
Для верификации результатов базовых кристаллоскопических исследований нами был применен спектрометрический анализ кристаллоскопических и тезиграфических фаций сыворотки крови животных (рис. 3 и 4).
Рис. 3. Уровень оптической плотности кристаллограмм сыворотки крови крыс сформированных групп.
Установлено, что у крыс с термической травмой оптическая плотность кристаллограмм существенно ниже, чем у здоровых животных (p<0,05), причем эта тенденция имеет место при всех использованных длинах волны и выражена примерно в равной степени при них (рис. 3). Это наблюдение четко согласуется с результатами базисных кристаллоскопических исследований, в которых показано значительное снижение количества структурных элементов, так и сложности и построения, что реализуется в форме статистически достоверного уменьшения кристаллизуемости и индекса структурности соответственно (p<0,05).
Проведение ингаляций воздушного потока синглетного кислорода способствует частичному восстановлению оптической плотности микропрепаратов дегидратированной сыворотки крови крыс, также имеющему место при всех изученных длинах волны, что подтверждает результаты кристаллоскопического исследования.
Рис 4. Уровень оптической плотности тезиграмм сыворотки крови крыс сформированных групп (базисное вещество – 0,9% раствор хлорида натрия).
Аналогичные сдвиги оптической плотности были зарегистрированы в отношении тезиграмм сыворотки крови крыс контрольной и основной групп (рис. 4). В то же время они были менее выражены по сравнению с характерными для кристаллограмм биологической жидкости.
Заключение. В целом, установлено, что данное воздействие у животных с тяжелой термической травмой способствует частичной нормализации кристаллогенной активности сыворотки крови, что положительно характеризует его реабилитационный потенциал. Важно, что эта тенденция имеет место при оценке и собственных кристаллогенных, и инициирующих свойств биологической жидкости, что проявляется как в динамике морфологических и морфометрических показателей, так и оптических характеристик фаций сыворотки крови.