Введение. Блеббинг лимфоцитов периферической крови - это процесс, который характеризуется выпячиванием цитоплазматической мембраны клеток, в результате нарушения мембран-цитоскелетных взаимодействий, вследствие активации специфических ферментативных реакций, окислительного повреждения белков цитоскелета, развития примембранного энергетического и ионного дисбаланса [1-3, 15, 16, 17]. Блеббинг рассматривается как интегральный параметр, отражающий действие повреждающих факторов на клетки, однако не является специфическим маркером повреждения клеток [5]. Ввиду того, что лимфоциты периферической крови одними из первых реагируют на развитие свободнорадикального окисления, а также активно участвуют в секреции про- и антивоспалительных медиаторов, межклеточных взаимодействиях, развитии эндотелиальной дисфункции, они являются идеальным объектом для изучения процессов мембранной дисфункции [7]. Наряду с вышеперечисленным, блеббинг лимфоцитов является малозатратным, своевременным и технически несложным в исполнении маркером воспалительного ответа и нарушения функции эндотелия [5-7].
Проблема локальной холодовой травмы в настоящее время не утратила свою актуальность [4, 10]. Высокий процент диагностических ошибок [9] и неудовлетворительные результаты специализированной помощи населению [8, 14] во многом определяются недостаточным изучением молекулярных механизмов развития холодовой травмы [11, 13] и сохраняющейся актуальностью поиска эффективных способов патогенетического воздействия [12].
Целью работы явилась оценка индекса блеббинга плазматической мембраны лимфоцитов периферической крови у пациентов с локальной холодовой травмой на фоне применения стандартного базисного лечения и системной озонотерапии.
Материалы и методы. В исследование были включены 80 пострадавших обоего пола в возрасте от 20-60 лет с локальной холодовой травмой II-IV степени в дореактивном и раннем реактивном периодах, находившихся на стационарном лечении во втором хирургическом отделении Красноярской межрайонной клинической больницы №7 с 2010-2013 г.
Критериями исключения больных из исследования стало наличие такой патологии как ВИЧ, сифилис, гепатит, сепсис, сахарный диабет, онкологические заболевания, геморрагический инсульт, инфаркт миокарда, ОНМК и др.
Все пациенты были разделены на три группы. Больные первой группы получали лечение по базисной схеме, включающее введение столбнячного анатоксина, инфузионную терапию, дезагреганты, антикоагулянты, спазмолитики, антибиотики, обезболивающие, местную терапию (операции по показаниям, перевязки). Пострадавшим второй группы наблюдения помимо стандартного лечения были назначены внутривенные инфузии озонированного изотонического раствора хлорида натрия (2-4 мг/л в объеме 250 мл через день, 5 сеансов). Третью группу составили больные, которым проводили сеансы большой аутогемотерапии с озоном (5 сеансов через день). Для выполнения этой процедуры, у пострадавшего осуществляли забор 100 мл периферической венозной крови с помощью роторного насоса «Исток-2» (г. Воронеж) со скоростью 10 мл/мин в стерильный пластиковый контейнер, предварительно содержащий 100 мл. физиологического раствора и 5 ЕД гепарина. После чего в контейнер, через дополнительный порт, вводили озоно-кислородную газовую смесь в количестве 100 мл., с концентрацией озона 10мг/л. В течение пяти минут перемешивали содержимое контейнера, затем с помощью реверса насоса возвращали кровь в вену больного. Для генерирования озоно-кислородной газовой смеси использовали озонотерапевтическую установку УОТА-60-01 производства ООО «Медозон» (Москва).
В четвертую (контрольную) группу вошли практически здоровые лица обоего пола в возрасте от 20 до 60 лет.
Определение индекса блеббинга плазматической мембраны лимфоцитов (ИБЛ) проводили на базе ЦКП НИИ молекулярной медицины и патобиохимии КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого. Для выделения лимфоцитарной фракции, у пациентов с локальной холодовой травмой при поступлении, на пятые и десятые сутки осуществляли забор 5 мл. периферической венозной крови в пробирку, содержащую гепарин. Транспортировку крови в лабораторию выполняли в течение часа с момента ее взятия. Методика выделения заключалась в следующем. К полученной крови добавляли фосфатный буфер в соотношении 1:1. После чего, в другую пробирку вносили Lympholyte® и производили медленное наслаивание на него содержимого первой пробирки (1:2). Вторую пробирку центрифугировали при 3000 оборотах в минуту в течение 15 минут. Далее производили удаление надосадочной жидкости и добавляли 500 мкл. фостатного буфера к осадку, с последующим ресуспензированием содержимого пробирки и раскапыванием его на предметные стекла.
Микроскопирование проводили с помощью люминесцентного микроскопа OLYMPUS CX 41 с фазово-контрастной насадкой и конфокального микроскопа OLYMPUS FVC-522-053W FV 10i. Для проведения расчетов анализировали 100 клеток.
Показатель индекса блеббинга лимфоцитов определяли по следующей формуле (1) [5, 6]:
Интактные лимфоциты представляли собой клетки округлой формы, с ровной поверхностью (рис. 1). У лимфоцитов, в состоянии начального блеббинга, визуализировались мелкие выпячивания на поверхности клеточной мембраны, занимающие не более 1/3 радиуса клетки (рис. 2). Поверхность плазматической мембраны лимфоцитов в состоянии терминального блеббинга была полностью деформирована мелкими везикулами, либо крупными, занимающими более 1/3 радиуса клетки (рис. 3, рис. 4).
Рис. 1. Интактные лимфоциты (фазово-контрастная микроскопия; х1000).
Рис. 2. Лимфоциты в состоянии начального блеббинга (фазово-контрастная микроскопия; х1000).
Рис. 3. Лимфоциты в состоянии терминального блеббинга (фазово-контрастная микроскопия; х1000).
Рис. 4. Интактный лимфоцит; лимфоцит в состоянии начального Блеббинга; лимфоцит в состоянии терминального блеббинга (конфокальная микроскопия в режиме фазового контраста; х6000).
Статистический анализ проведен методами непараметрической статистики. Количественные показатели представлены в виде медианы (Ме) и перцентилей [Р25; Р75].
Для сравнения независимых выборок был использован критерий Краскела-Уоллеса, для зависимых - Фридмена. После отклонения нулевой гипотезы об отсутствии различий групп, выполнено парное сравнение групп с помощью критерия Манна-Уитни и Вилкоксона с поправкой Бонферрони. Для расчетов применялась программа SPSS 19.0.
Результаты исследования. Среди обследуемых были лица обоего пола. Доля мужчин составила 86,25%, женщин - 13,75%. Большинство пациентов с отморожениями были трудоспособного возраста (95%) (табл. 1), однако доля работающих граждан составила лишь 30%. 12,5% пострадавших от локальной холодовой травмы не имели определенного места жительства. В 26,25% случаев больные поступали в состоянии алкогольного опьянения. II степень отморожения была диагностирована у 32,5% пострадавших, III - у 27,5%, IV - у 40%.
Таблица 1. Распределение пострадавших по полу и возрасту
Динамика уровня индекса блеббинга лимфоцитов у пациентов с локальной холодовой травмой на фоне применения базисного лечения и медицинского озона, в составе комплексной терапии, представлены в табл. 2.
Таблица 2. Показатели индекса блеббинга лимфоцитов у пациентов с локальной холодовой травмой на фоне применения различных схем лечения
Из табл. 2 видно, что значения ИБЛ у больных с отморожением при поступлении, значимо превышали показатели контрольной группы, более чем в два раза. На фоне применения стандартных схем терапии, значения анализируемого параметра у пациентов первой группы достоверно не изменились к десятым суткам госпитализации, более того отмечалась незначимая тенденция к их повышению. У пострадавших, в лечение которых были включены внутривенные инфузии озонированного физиологического раствора, отмечалось постепенное снижение значений индекса блеббинга лимфоцитов к десятому дню стационарного лечения, что было подтверждено результатами статистического анализа (р=0,007). У больных, которым помимо базисного лечения были назначены сеансы большой аутогемотерапии с озоном, исследуемый параметр также снижался на пятые и десятые сутки по сравнению с показателями, полученными при поступлении. Следует отметить, что максимальное внутригрупповое снижение индекса блеббинга лимфоцитов, на фоне проводимой терапии, наблюдалось у пациентов третьей группы. Показатели ИБЛ, зарегистрированные на пятый и десятый дни госпитализации у данных больных, были значимо ниже уровней во второй группе наблюдения.
Выводы. Таким образом, уровень индекса блеббинга плазматической мембраны лимфоцитов у пострадавших в ранние периоды локальной холодовой травмы превышает среднефизиологические значения более чем в два раза. Применение системной озонотерапии, в составе комплексного лечения пострадавших с локальной холодовой травмой, способствует значимому снижению уровня индекса блеббинга лимфоцитов, характеризующего выраженность системного воспалительного ответа и действия повреждающих факторов на лимфоциты. ИБЛ позволяет мониторировать эффективность использования системной озонотерапии в составе базисных схем лечения пациентов с отморожением.