Введение. Необходимость изучения особенностей структурной организации семенников определяется его участием в выполнении важных функций для организма - выработке сперматозоидов и продукции мужских половых гормонов [2, 7].
Несмотря на наличие работ, посвященных изучению особенностей структурной организации семенников [6, 8, 9], многие вопросы остаются нерешенными либо требуют уточнения [3, 16, 20].
Целью работы явилось изучение морфологических особенностей семенников самцов белых крыс в связи со становлением репродуктивной функции.
Материалы и методы исследования. В качестве биологического тест-объекта в работе использовали белых половозрелых крыс-самцов массой 200-250 г. в возрасте 60 суток, т. к. согласно литературным данным период полового созревания у крыс наступает на 60-й день [1, 12]. Всего использовано 50 животных. Материалом исследования служили семенники самцов белых крыс.
Животные забивались путем декапитации под наркозом эфира с хлороформом (1:1) с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации, и в соответствии с требованиями правил проведения работ с использованием экспериментальных животных.
Вес семенников измеряли при помощи аналитических весов Sartorius (Германия).
Для гистологического исследования образцы тканей семенных желез фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина. Зафиксированные образцы после промывки в проточной воде подвергали обезвоживанию путем помещения исследуемого материала в спирты возрастающей концентрации и заливали в парафин по общепринятой методике. Готовили гистологические поперечные срезы семенных желез толщиной 10-15 мкм, окрашивали их гематоксилин-эозином по общепринятой методике.
Образцы тканей исследовали с помощью цифрового микроскопа Axio Imager.M2 (ZEISS, Япония) с программным обеспечением для анализа изображений AxioVision SE64 Rel. 4.8.3 и ZEN 2011. Фотосъемку препаратов производили цифровой камерой AxioCam MRc5 (ZEISS, Япония) с последующей обработкой изображения в Abode Photoshop Elements 11.
При обзорной микроскопии изучали морфологические особенности строения семенников, после чего определяли следующие морфометрические параметры:
1) толщину белочной оболочки семенников;
2) количество извитых семенных канальцев в одном поле зрения, площадь поперечного сечения извитого семенного канальца и его просвета, площадь сперматогенного эпителия и его толщину;
3) количество участков интерстиция между извитыми семенными канальцами в одном поле зрения, а также их площадь;
4) количество миоидных клеток в стенке извитого семенного канальца, площадь миоидных клеток и их ядер;
5) количество клеток Сертоли в сперматогенном эпителии извитого семенного канальца, ширину базальной и длину апикальной частей клеток Сертоли, площадь клеток и их ядер;
6) количество разных видов сперматогенных клеток (сперматогоний, сперматоцит и сперматид) в сперматогенном эпителии извитого семенного канальца, площадь сперматогенных клеток и их ядер, длину и толщину жгутика поздних сперматид;
7) количество сперматозоидов в просвете извитого семенного канальца, площадь головки и ядра, ширину шейки и длину хвостовой части;
8) количество клеток Лейдига в участке интерстиция; площадь клеток Лейдига и их ядер;
9) отношение площади интерстициальной ткани к площади извитых семенных канальцев составляет в одном поле зрения препарата.
Морфометрические измерения семенников проводили при увеличении 10×10, 40×10 и 100×10.
Разрешение полученных изображений - 1300×1030 пикселей.
На основе количественных данных, полученных при цитологическом исследовании семенников, рассчитывали ряд информативных показателей, характеризующих состояние сперматогенеза в семенниках самцов белых крыс.
К этим показателям относятся:
1) сперматограмма - процентное распределение клеток сперматогенного эпителия в одном извитом семенном канальце [14].
2) индекс сперматогенеза - отношение суммы всех подсчитанных слоев клеток в одном канальце к количеству всех просчитанных канальцев.
Индекс сперматогенеза рассчитывали по формуле: Is=∑a/N, где а - количество слоев, выделенных в каждом канальце (первый слой - сперматогонии, второй - сперматоциты, третий - сперматиды, четвертый - сперматозоиды); N - количество просчитанных канальцев [5].
3) индекс релаксации (напряженности сперматогенеза) - отношение суммы всех сперматогенных клеток к сумме клеток Сертоли в одном извитом семенном канальце [14].
4) индекс созревания - отношение суммы юных (сперматогонии, сперматоциты) и зрелых форм сперматогенного эпителия (сперматиды, сперматозоиды) в одном извитом семенном канальце.
5) индекс мейотической активности - отношение суммы мейотических клеток (сперматоцитов) к сумме остальных половых клеток в одном извитом семенном канальце
6) герминативный индекс - отношение суммы сперматогоний к сумме клеток Сертоли в одном извитом семенном канальце [13].
Статистическая обработка цифровых данных осуществлялась с помощью программ FStat и Excel. Проверка статистических гипотез осуществлялась по t-критерию Стьюдента. При оценке статистических гипотез принимались следующие уровни значимости: p≤0,05.
Результаты исследования и их обсуждение. Наружный осмотр семенников крыс-самцов показал, что они розовато-белого цвета, мягко-эластической консистенции, эллиптической формы. Вес семенников составил 0,588±0,014 г. Причем масса левого семенника несколько превышает массу правого.
При малом увеличении микроскопа заметна розовая полоса, идущая по краю препарата - это белочная оболочка, состоящая из плотной неоформленной соединительной ткани. Основную массу семенника образуют семенные извитые канальцы, разрезанные поперек или косо (тангенциально), округлой или эллипсовидной формы. Семенные канальцы отделены друг от друга тонкой оболочкой интерстициальной соединительной ткани, под которой находится толстая стенка сперматогенного эпителия на разных стадиях развития. Участки интерстиция между извитыми семенными канальцами расположены равномерно, преимущественно треугольной формы. В центре извитого канальца имеется просвет, куда выходят образованные спермии. Даже при слабом увеличении заметно, что в разных канальцах проходят разные стадии сперматогенеза (рис. 1).
При большом увеличении видно, что собственная оболочка канальца построена из волокон соединительной ткани. Кнаружи от базальной мембраны расположен слой рыхлой соединительной ткани, в котором находится слой миоидных клеток, имеющих чешуйчатую, полулунную и удлиненную форму. Миоидные клетки располагаются равномерно по всему контуру извитого семенного канальца. Внутрь от собственной оболочки, отделенной базальной мембраной, располагается сперматогенный эпителий.
Гистологические исследования семенников белых крыс показали, что первый наружный слой сперматогенного эпителия в извитых семенных канальцах составляют лежащие на базальной мембране сперматогонии с темным оптически плотным ядром и узким ободком цитоплазмы.
Ближе к центру канальца располагаются сперматоциты. Это крупные клетки с большим ядром и широким ободком цитоплазмы, имеют округлую форму.
Самый внутренний слой извитого канальца составляют сперматиды, мелкие со светлым ядром клетки, лежащие в несколько рядов. Ранние сперматиды округлой формы со сферическим ядром находятся в средних слоях сперматогенного эпителия. Поздние сперматиды лежат в слое, прилегающем к просвету канальца, имеют вытянутую форму. У некоторых поздних сперматид обнаруживается жгутик. В некоторых канальцах видны сформированные сперматозоиды. Их темные вытянутые головки направлены на периферию канальца, а хвосты свисают в просвет канальца (рис. 2).
Сперматозоиды в просвете извитого семенного канальца располагаются группами в количестве 6-8 по всему контуру просвета. Головка сперматозоидов имеет форму крючка (рис. 3).
Рис. 1. Поперечный срез семенных желез. Окраска гематоксилин-эозин. Об. 40 × ок. 10: 1 - извитой семенной каналец; 2 - сперматогенный эпителий; 3 - просвет канальца; 4 - интерстициальная ткань.
Рис. 2. Извитой семенной каналец. Окраска гематоксилин-эозин. Об. 40 × ок. 10: 1 - миоидные клетки; 2 - клетки Сертоли; 3 - дифференцирующиеся сперматогонии; 4 - сперматоциты; 5 - ранние сперматиды; 6 - поздние сперматиды; 7 – сперматозоиды.
Рис. 3. Сперматозоиды самцов белых крыс в просвете извитого семенного канальца. Окраска гематоксилин-эозин. Об. 100 × ок. 10.
В интерстициальной ткани семенников состоящей из рыхлой соединительной ткани, выявлены кровеносные сосуды, вокруг которых залегают с большим сферическим ядром одиночные, или чаще группами по 5-7 клеток, крупные овальной или многоугольной формы клетки Лейдига. Общее количество гландулоцитов в одном участке интерстиция достигало 10-12 шт. (рис. 4).
Рис. 4. Интерстициальная ткань семенных желез. Окраска гематоксилин-эозин. Об. 100 × ок. 10: 1 - участок интерстиция; 2 - клетки Лейдига; 3 - кровеносный сосуд.
Морфометрические исследования показали, что толщина белочной оболочки семенников самцов белых крыс равна 35,23±3,42 мкм.
Морфометрические показатели извитых семенных канальцев семенников и окружающих их участков интерстициальной ткани самцов белых крыс показаны в табл. 1 и 2.
Таблица 1. Морфометрические показатели извитых семенных канальцев семенников самцов белых крыс (M±m)
Таблица 2. Морфометрические показатели интерстициальной ткани семенников самцов белых крыс (M±m)
Соотношение площади интерстициальной ткани к площади извитых семенных канальцев в одном поле зрения препарата составляет примерно 1:30.
Изучение состояния процесса сперматогенеза говорит о интенсивном протекании этого процесса в семенниках самцов белых крыс (рис. 5, табл. 3, 4).
Рис. 5. Сперматограмма самцов белых крыс.
Таблица 3. Количественное соотношение отдельных типов сперматогенных клеток в извитом семенном канальце семенников самцов белых крыс (M±m)
Таблица 4. Измерение функциональной активности семенников самцов белых крыс (M±m)
Заключение. Развитие и половая дифференцировка семенников являются сложным процессом. Важнейшим показателем структурно-функционального становления семенника является характеристика сперматогенного пласта [4].
Для оценки сперматогенного пласта экспериментальных животных нами производился подсчет суммарного содержания сперматогенных клеток, в том числе сперматогоний различной степени зрелости, сперматоцитов, сперматид и сперматозоидов, а также индексов сперматогенеза, релаксации, созревания, мейотической активности и герминативного индекса.
Подсчёт сперматогоний вели, начиная с 60-го дня постнатального онтогенеза, поскольку, согласно современным представлениям о процессах сперматогенеза, у крыс в период новорожденности практически все сперматогенные клетки являются гоноцитами [22], образование первых сперматогоний датируется 3-6 днем постнатального онтогенеза [15, 18]. Согласно данным литературы, первые сперматозоиды в семенных извитых канальцах крыс образуются к 43-му дню жизни [22].
Анализ суммарного содержания сперматогенных клеток в семенных извитых канальцах показал, что у экспериментальных животных в возрасте 2-х месяцев постнатального развития наибольший процент из всего количества сперматогенных клеток составляют зрелые мужские половые клетки - сперматозоиды. Вторыми в количественном отношении являются мужские стволовые клетки - сперматогонии. Содержание в извитых семенных канальцах сперматоцит и сперматид находится примерно в одинаковом процентном соотношении от всего количества сперматогенных клеток, что очевидно объясняется достижением к этому периоду максимальных темпов предмейотического сперматогенеза, вследствие чего данные популяции клеток стабилизируются в численности [21].
Наибольший процент сперматозоидов, очевидно, показывает на приостановление апоптоза сперматоцитов у половозрелых животных [17-19].
Результаты количественных исследований семенников показывают, что площадь извитых семенных канальцев у крыс увеличивается в процессе роста организма животного, а после наступления половой зрелости отличается постоянством, в связи, с чем этот показатель служит достоверным критерием, отражающим структурно-функциональное состояние мужских гонад [11].
Полученные нами данные совпадают с литературными. Нами установлено, что к 2-м месяцам постнатального развития самцов белых крыс соотношение площади интерстициальной ткани к площади извитых семенных канальцев составило примерно 1:30.
Важнейшим количественным показателем, характеризующим генеративную активность семенника, является индекс сперматогенеза, отражающий количество генераций сперматогенных клеток в стенке извитых семенных канальцев [10]. Изучение индекса производили, начиная с 60-го дня постнатального онтогенеза, так как к этому периоду заканчивается миграция гонобластов и проходит первая волна сперматогенеза [22].
Анализ данного показателя позволил зафиксировать его высокий уровень (3,32±0,15), что очевидно связано с переходом к полноценному процессу сперматогенеза, завершающемуся формированием сперматозоидов.
Полученные результаты убедительно свидетельствуют о половозрелости экспериментальных животных.
Выводы
- При помощи гистологических и морфометрических методов исследования показаны особенности строения семенников самцов белых крыс в связи с формированием процесса сперматогенеза.
- Установлено, что у крыс-самцов в возрасте 18-20 месяцев в семенниках соотношение площади интерстициальной ткани к площади извитых семенных канальцев составляет примерно 1:30.
- Показано, что в период половозрелости самцов белых крыс наибольший процент из всего количества сперматогенных клеток составляют зрелые мужские половые клетки - сперматозоиды. Вторыми в количественном отношении являются мужские стволовые клетки - сперматогонии. Эти показатели подтверждают такие показатели, как: индекс созревания, индекс мейотической активности и герминативного индекс.
- На высокую репродуктивную активность семенных желез указывают такие рассчитанные показатели, характеризующие состояние сперматогенеза в семенниках самцов белых крыс, как: индекс сперматогенеза, индекс релаксации (напряженности сперматогенеза).
Благодарности. Работа проводилась в рамках программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («УМНИК») при финансовой поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (проект «Исследование морфофункциональных особенностей органов репродуктивной системы при антропогенном воздействия свинца»).