Введение. Рак шейки матки (РШМ) является одной из наиболее распространенных опухолей у женщин репродуктивного возраста. Известно, что в процессе цервикального канцерогенеза происходит модификация жирнокислотного состава мембран клеток экзоцервикса, что потенцирует дестабилизацию сигнальных путей, контролирующих основные процессы в клетке [1, 2].
Цель исследования - провести корреляционный анализ полученных нами ранее величин спектра высших жирных кислот (ВЖК) тканевых липидов клеток шейки матки, с одной стороны, и параметров пролиферативной активности, апоптоза и кинетики фаз клеточного цикла экзоцервикса при дис- и неопластической трансформации, с другой.
Материалы и методы исследования. В работе были использованы полученные нами ранее лабораторные данные [1, 2]. В качестве образцов для исследования служили фрагменты шейки матки, полученные путем прицельной ножевой биопсии или в ходе проведения оперативного лечения.
Исследуемые группы: I - больные с предраковыми заболеваниями шейки матки (n=32). II клиническую группу составили пациентки с впервые выявленным диагнозом РШМ Iа - Ib стадии (n=45). Образцы контрольной группы были взяты у 25 гинекологически здоровых женщин-добровольцев, ознакомленных с дизайном исследования и давших информированное согласие на участие в нем. Средний возраст обследуемых составил 38±8,26 лет.
Все обследуемые лица были информированы о проводимой работе и дали свое письменное согласие на участие в ней. Исследование проведено с соблюдением принципов Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (WMA Declaration of Helsinki, 1964, 2013 ред.) c согласия Локального этического комитета Читинской государственной медицинской академии.
Для получения клеточной суспензии кусочки биоптата измельчали и гомогенизировали в гомогенизаторе Gentle MACS Dissociator (Miltenyi Biotec GmbH, Германия) с пробирками С типа и с использованием набора реагентов Tumor Dissociation Kit (Miltenyi Biotec GmbH, Германия). Затем суспензию клеток фильтровали через капроновый фильтр размером ячеек 30 мкм. Полученные клетки отмывали среде RPMI-1640 с добавлением 10 % телячьей сыворотки и стандартного набора антибиотиков.
Для изучения спектра ВЖК липиды экстрагировали методом J. Folch (1957) [11]. После упаривания аликвота ВЖК метилировалась по К.М.Синяк с соавт. (1976) [4]. Затем метиловые эфиры очищались в тонких слоях силикагеля в хроматографической системе гексан:диэтиловый эфир:ледяная уксусная кислота (90:10:1 по объему), экстрагировались смесью хлороформ:метанол (8:1) и анализировались на хроматографе «Кристалл- 2000М» (Россия) с плазменно-ионизационным детектором и капиллярной колонкой 0,35×50 FFAP (USA). Для калибровки прибора применялся стандарт смеси ЖК. Обсчет, идентификация пиков осуществлялись с помощью программно-аппаратного комплекса «Analitika».
Регистрацию апоптоза, фаз клеточного цикла в выделенных клетках осуществляли с помощью проточной цитофлуометрии FC500 с использованием набора реагентов Annexin V Kit.
Приводим расшифровку обозначений
Спектр высших жирных кислот: С14:0 - миристиновая, С14:1 - миристоолеиновая, С15:0 -пентадекановая, С15:1 - пентадекаеновая, С16:0 - пальмитиновая, С16:1 - пальмитолеиновая, С17:0 - маргариновая, С17:1 - гептадекаеновая, С18:0 - стеариновая, С18:1 - олеиновая, C18:2ω6 -линолевая, C18:3ω6 - γ-линоленовая, C18:3ω3 - α-линоленовая, С19:0 - α-метилстеариновая, С20:0 - арахиновая, C20:3ω6 - дигомо-γ-линоленовая кислота, C20:4ω6 - арахидоновая, C20:5ω3 - эйкозапентаеновая, C22:5 ω3 - докозапентаеновая кислоты.
Пролиферативная активность, апоптотическая реактивность, некротический потенциал клеток: CD45 (-), Ki-67 (+) эпителиальные, пролиферирующие клетки; CD45-, Ki67+, А+ клетки, находящиеся в раннем апоптозе; CD45-, Ki67+, А+, Р+ клетки, находящиеся в позднем апоптозе; CD45-, Ki67+, Р+ клетки, находящиеся в стадии некроза.
Для выявления корреляционных взаимосвязей между уровнем ВЖК, с одной стороны, и пролиферативной активностью, апоптотической реактивностью и кинетикой фаз клеточного цикла экзоцервикса, с другой, производился корреляционный анализ Спирмена.
Результаты исследования. Анализируя полученные данные, можно констатировать, что корреляционные связи между изучаемыми параметрами многообразны и определяются наличием или отсутствием двойных связей у ВЖК, а также их количеством, числом атомов углерода в цепи и степенью поражения клеток цервикального эпителия. Данный факт кажется логичным, учитывая их многогранные и разнонаправленные эффекты в патогенезе неоплазий. Представители данного класса соединений оказывают как ко-, так и антиканцерогенное действие [5, 6, 14, 17]. Результаты исследования представлены в табл. 1-5 с указанием только статистически значимых корреляций.
Изучив взаимосвязи насыщенных жирных кислот с пролиферативной активностью, апоптотической способностью клеток, фазами клеточного цикла, можно заключить, что их суммарный эффект определяется как потенцирующий опухолевому процессу. Подтверждением этого является то, что во-первых, обнаружены положительные корреляции средней и сильной степени выраженности между величинами С14:0 («предрак» очаг r=0,88, p<0,001), С16:0 (локус неоплазии r=0,53, p=0,023 и очаг «предрака r=0,88, p<0,001) и пулом пролиферирующих клеток (табл. 2, 4). Необходимо подчеркнуть наличие прямой зависимости между концентрацией насыщенных аналогов с нечетным числом атомов углерода и долей пролиферативных клеток, а именно С19:0 в участке цервикального рака (r=0,75, p=0,001), С15:0 и С17:0 в парадиспластических клетках (r=0,92, p=0,001; r=0,82, p=0,001 соответственно) (табл. 3, 4). Кроме того, следует указать на наличие положительных корреляций между С15:0, С17:0 и долей клеток в G2-М фазе клеточного цикла (локус «предрака» r=0,71, p<0,001; r=0,86; p<0,001) (табл. 2). Полученные данные согласуются со сведениями литературы о возможном участии данных соединений в процессах пролиферации, дедифференцировки и опухолевой прогрессии [3, 6].
Таблица 1. Коэффициент корреляции Спирмена между величинами ВЖК, пролиферативной активностью, апоптотической реактивностью, некротическим потенциалом, параметрами клеточного цикла в клетках шейки матки контрольной группы
Таблица 2. Коэффициент корреляции Спирмена между величинами ВЖК, пролиферативной активностью, апоптотической реактивностью, некротическим потенциалом, параметрами клеточного цикла в очаге диспластической трансформации
Таблица 3. Коэффициент корреляции Спирмена между величинами ВЖК, пролиферативной активностью, апоптотической реактивностью, некротическим потенциалом, параметрами клеточного цикла в парадиспластических клетках
Таблица 4. Коэффициент корреляции Спирмена между величинами ВЖК, пролиферативной активностью, апоптотической реактивностью, некротическим потенциалом, параметрами клеточного цикла в малигнизированных клетках
Таблица 5. Коэффициент корреляции Спирмена между величинами ВЖК, пролиферативной активностью, апоптотической реактивностью, некротическим потенциалом, параметрами клеточного цикла в паранеопластических клетках
Во-вторых, присутствуют отрицательные корреляции между количеством С16:0 и долей G0-G1 клеток в локусе рака (r=-0,57; p=0,015) (табл. 4). Данный факт, на наш взгляд, можно объяснить ингибирующим влиянием С16:0 на состояние внутриклеточного белка р21, поскольку есть указания на возможность блокирования его экспрессии насыщенными жирными кислотами, такими как пальмитиновая, стеариновая и миристиновая [7]. Известно, что протеин р21 является одним из регуляторов клеточного цикла, блокирующих циклины D/Cdk4/6 и E/Cdk2, тем самым формируя G1-S блок [7]. Данная «стоп-точка» клеточного цикла необходима для запуска апоптоза. В условиях ее отсутствия «дефектная» клетка с поврежденной ДНК проскакивает фазы клеточного цикла, вступая в митоз. По данным литературы повышенный синтез насыщенных аналогов в очаге рака и при предраковых состояниях может являться фактором, провоцирующим опухолевую прогрессию и химиорезистентность опухолей [7].
В-третьих, выявлены положительные сильные связи между уровнями С15:0, С17:0 (локус «предрака» r=0,71, p<0,001; r=0,86; p<0,001 соответственно), С16:0, С18:0, С20:0 (парадиспластические клетки r=0,82, p<0,001; r=0,85; p<0,001; r=0,86, p<0,001 соответственно) и долей G2-М клеток (табл. 2, 3). Возможным объяснением данного факта может быть их связывание с рецептором активации пролиферации пероксисом, что вызывает экспрессию генов, ответственных за пролиферацию, дифференцировку, апоптоз и иммунный ответ, хотя данный факт более характерен для полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) [5].
Выявленные корреляционные связи между отдельными представителями мононенасыщенных жирных кислот (МНЖК) и долей пролиферирующих клеток (прямая зависимость в очаге рака для С15:1 r=0,6, p=0,009); количеством клеток, находящихся в стадии раннего и позднего апоптоза, а также некроза (обратная зависимость в локусе малигнизации для С15:1, С16:1 r от -0,59 до -0,54 р<0,05); G0-G1 и G2/М- клетками (обратная зависимость в локусе малигнизации) свидетельствуют об участии моноеновых кислот в цервикальном канцерогенезе, реализуя коканцерогенные эффекты (таблицы 2, 4). По данным D. Hess et al. (2010), МНЖК являются ключевыми молекулами для пролиферации раковых клеток [8, 13]. В современной литературе появились сведения о канцерогенном эффекте стеароил-КоА десатуразы 1 (scd1) - ключевого фермента в биосинтезе МНЖК [13]. Молекулярные механизмы, с помощью которых SCD1 влияет на клеточный цикл, в большей степени неизвестны, однако, есть исследования, подтверждающие влияние этого энзима на активность циклинов D1 и Cdk6, контролирующих G1-S переход [13, 14].
Согласно современным представлениям, влияние ПНЖК на онкогенез неоднозначно [6, 17]. Так, полиеновые аналоги ω3 серии обладают антиканцерогенным действием. Подтверждением данного факта является выявленное нами наличие обратной корреляционной зависимости между долей клеток, находящихся в фазе G2-М клеточного цикла, и пулом α-линоленовой кислоты в паранеопластических клетках (r=-0.59, p=0,012) (табл. 5), а также присутствие отрицательных корреляций между величиной последней и количеством высокопролиферативных клеток в очаге цервикального рака (r=-0,54, p=0,023) (табл. 4), положительных взаимосвязей между С18:3ω3 и долей клеток, находящихся в стадии раннего и позднего апоптоза (в локусе «предрака» и парадиспластических клетках (r от 0,72 до 0,84, р<0,001)) (таблицы 2, 3). Этот факт согласуется и с данными источников литературы. D.L. Schiessel et al. (2015) сообщили об ингибирующем влиянии С18:3ω3 на опухолевый рост, симптомы раковой интоксикации у крыс-опухоленосителей [16]. A.K. Wiggins et al. (2015) указали на ее антипролиферативный и проапоптотический эффекты, выявленные на культуре клеток рака молочной железы, что согласуется с результатами нашего исследования [17]. A. Beaulieu et al. (2011) объяснили антиканцерогенный эффект С18:3ω3 за счет возможности ингибирования PI3K сигнального пути, непосредственно регулирующего процессы пролиферации и дифференцировки клеток, а также блокирования активности антиапоптотического белка Bcl-2 [10].
С20:5ω3 также опосредует противораковое действие, учитывая наличие отрицательных корреляций с пулом пролиферирующих клеток (группа контроля r=-0,65, p=0,02) (табл. 1). Т. Terano et al. (1999) указали на возможность эйкозопентаеновой кислоты модуляции фаз клеточного цикла и пролиферативной способности гладкомышечных клеток сосудов путем ингибирования фосфолирирования Cdk2 белка и активности Cdk2 киназы, регулирующих G1-S переход. Вероятно, поэтому пул данной кислоты был взаимосвязан положительными взаимосвязями с долей G0-G1 клеток в группе контроля [17]. Кроме того, известно, что проапоптотический эффект С20:5ω3 реализуется через активацию jnk-сигнального пути, индукцию выброса цитохрома С и активацию каспаз-3 и 9 [9, 10].
ПНЖК ω6 серии проявляют коканцерогенные эффекты [4, 5, 10]. Выявленные нами закономерности также указывают на их коканцерогенное действие: отрицательные связи между уровнем арахидоновой кислоты и пулом клеток, находящихся в раннем апоптозе в локусе цервикального рака (r=-0,7, p=0,002) (табл. 4), положительные корреляции - между концентрацией С20:4ω6 и долей высокопролиферирующих клеток в очаге «предрака» (r=0,88, p<0,001) и парадиспластических клетках (r=0,84, p<0,001) указывают на ее коканцерогенное действие (табл. 2, 3). Данный эффект можно объяснить активным участием метаболитов арахидоновой кислоты (простагландинов и лейкотриенов) в опухолевом процессе, стимулирующих пролиферацию, инвазию и прогрессию онкологического заболевания, а также оказывающих иммуносупрессивное, антиапоптотическое действие [5].
Линолевая кислота также потенцирует развитие опухолевого процесса. Выявленные положительные корреляции средней и сильной силы между уровнем последней и долей пролиферирующих клеток в группе контроля (r=0,6, p=0,015) и локусе «предрака» (r=0,86, p<0,001), а также обнаружение прямых взаимосвязей между ее пулом и количеством клеток, находящихся в S фазе клеточного цикла в паранеопластических (r=0,49, p=0,041) и парадиспластических биоптатах шейки матки (r=0,82, p=0,001), указывают на ее коканцерогенные эффекты.
Сходные эффекты выявлены при изучении факторов канцерогенеза молочной железы: N. Reyes et al. (2004) установили стимулирующее влияние С18:2ω6 на рост клеточной линии рака молочной железы. Исследователи доказали, что данный эффект определяется влиянием линолевой кислоты на активность р38 МАР киназы, участвующей в регуляции клеточного цикла, пролиферации, дифференцировки и апоптоза [10, 15].
Выводы. Наличие корреляционных связей разной направленности между уровнями высших жирных кислот тканевых липидов клеток шейки матки и показателями пролиферативной активности, апоптоза и кинетики фаз клеточного цикла экзоцервикса свидетельствуют о взаимообусловленности их влияния на цервикальный онкогенез.