Вовлеченность функциональной активности рибосомных генов в формировании первичного остеоартроза крупных суставов

Курский государственный медицинский университет

Актуальность. Остеоартроз, это группа наиболее распространенных заболеваний опорно-двигательной системы человека, мультифакториальной природы, которым в настоящее время страдает до 8-10% населения планеты [1,2]. По данным Минздравсоцразвития РФ с 2000 по 2009 год число больных остеоартрозом увеличилось более чем в 2 раза, причем темпы увеличения распространенности заболевания будут нарастать [3,4]. Основной причиной развития первичного остеоартроза крупных суставов являются дегенеративные процессы, происходящие в суставном хряще [5]. Основой межклеточного матрикса суставного хряща является коллаген II-го типа. Первично-образующиеся полипептидные цепи проколлагена II-го типа кодируются геном COL IIA [6], однако уровень белоксинтезирующей функции клеток также зависит от дозы активных рибосомальных генов и количеством 18S pPНК в клетках. Число рибосом, и как следствие и вся белоксинтезурющая функция клеток определяются дозой активных рибосомальных генов, кодирующих развитие рРНК. [7] При снижении числа рибосом происходит уменьшении синтеза межклеточного вещества хондроцитами, нарушается нормальная цитоархитектоника хряща, снижаются прочностные свойства и возможность противостоять длительным систематическим нагрузкам[8],

Таким образом, оказывается очень важной роль рибосомных генов в патогенезе первичного остеоартроза, т.к. они регулируют уровень белкового синтеза [9] и участвуют в построении цепей коллагена [10].Общеизвестно, что уровень активности рибосомальных является относительно постоянной величиной в течение жизни индивидуума, отмечается лишь незначительное его повышение в пренатальном периоде жизни.[11] Таким образом, компенсаторные возможности суставного хряща сопротивляться нагрузкам также детерминированы. Однако, работ, посвященных исследованию уровня активности рибосомных генов, как регуляторов основного белкового обмена организма, и изменения их уровня при заболеваниях опорно-двигательной системы, а также возможной вовлеченности в патогенез первичного остеоартроза крупных суставов нами не обнаружено.

Цель исследования - изучение вовлеченности функциональной активности рибосомальных генов в патогенез первичного остеоартроза крупных суставов.

Материалы и методы. Для определения вовлеченности рибосомных генов в патогенез первичного остеоартроза, были обследованы 98 пациентов (все уроженцы Курской области), проходивших стационарное лечение на базе травматолого-ортопедических отделений Курской городской клинической больницы № 4 в 2012-2013 годах.

Из 98 пациентов исследуемой группы женщины составили 68 (69,4%), мужчины 30 (30,6%). Средний возраст пациентов составил 63,2±15,8 лет. Преобладали люди в возрасте 55 до 65 лет. Контрольная группа составила 65 человек, не страдающих заболеваниями опорно-двигательной системы, также у данных пациентов отрицались онкологические заболевания, сахарный диабет, заболевания сердечно-сосудистой системы. Из них 45 женщин (69,2%), мужчин 20 (30,8%). Средний возраст составил 61,1±8,9 лет. Преобладающей возрастной группой являлись люди в возрасте 55-65 лет.

Всем пациентам проводилось стандартное обследование для постановки диагноза «первичный остеоартроз» (клиническое обследование, рентгенологическое исследование). Исследуемую группу составили пациенты с диагнозами «первичный коксартроз» и «первичный гонартроз».

Для проведения цитогенетических исследований использовалась венозная кровь, в объеме 5 мл, которая помещалась в гепаринизированные стерильные флаконы и доставлялась в генетическую лабораторию. Препараты хромосом получали непрямым методом культивирования из лимфоцитов периферической крови. Сама процедура проводилась в специальном боксовом помещении по следующей рабочей схеме. В каждый стерильный культуральный флакон вносилось 0,6 мл цельной гепаринизированной крови, далее 0,1 - 0,2 мл фитогемагглютинина (ФГА). Через 1-2 минуты, после наступления агглютинации, во флакон добавлялось 6,0 мл культуральной среды RPMI-1640, смешанной с раствором глютамина и витаминами, и 1,5 мл сыворотки крупного рогатого скота. Флаконы с культуральной смесью плотно закрывались стерильными резиновыми пробками, встряхивались и помещались для культивирования в термостат при 37˚С сроком на 72 часа.

Обработка культур лимфоцитов и приготовление из них препаратов метафазных хромосом осуществлялись с применением ряда последовательных методических процедур: колхицинизации, гипотонизации культур, фиксации клеток смесью этилового спирта с уксусной кислотой, нанесении клеточной взвеси на предметные стекла [12].

Колхицин добавлялся за 1,5-2 часа до начала фиксации в конечной концентрации 0,5 мкл/мл. По окончании инкубации на 72 часе после стимуляции ФГА культуральная смесь из каждого флакона сливалась в чистые маркированные центрифужные пробирки и подвергалась центрифугированию в течение 10 минут при 1000 оборотах в минуту. Затем удалялась надосадочная жидкость, осадок ресуспендировался и к нему добавлялся предварительно нагретый до 37˚С гипотонический раствор (0,55% раствор KCl). Гипотонизация проводилась в термостате в течение 20 минут. Далее клетки центрифугировались, удалялась надосадочная жидкость, осадок ресуспендировался и подвергался фиксации. В качестве фиксирующей смеси использовался этанол и ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1. Первая фиксация проводилась при температуре - 10˚С в течение 20 минут. Затем фиксатор сменялся 2-3 раза с промежуточным центрифугированием. Показателем завершенности фиксации служила бесцветность, прозрачность клеточной суспензии. Полученная взвесь раскапывалась на охлажденные химически чистые предметные стекла.

После высушивания препараты маркировались и до окраски хранились при комнатной температуре [13].

Для специфического выявления районов ядрышковых организаторов использовался метод дифференциальной окраски хромосом нитратом серебра, предложенный Howell и Black с некоторыми модификациями [14]. На препарат под каждое покровное стекло наносилось 50 мкл. бидистиллированной деионизированной воды, 150 мкл 50%-го раствора нитрата серебра и 100 мкл коллоидного проявляющего раствора (2% раствор желатина в 0,1% растворе муравьиной кислоты) и инкубировалось во влажной камере в термостате при температуре 56,7-60˚С 40-60 минут. После промывки под струей проточной воды каждый препарат высушивался и при необходимости докрашивался 1%-ым раствором красителя Гимза на фосфатном буфере (рН 6,8).

Дальнейший цитогенетический анализ проходил в двух направлениях:

  1. Бальная оценка суммарного уровня функциональной активности рибосомных генов (ФАРГ).
  2. Подсчет количества функционально активных рибосомных цистронов.

Во всех случаях анализировались только цельные, обособленные друг от друга метафазные пластинки со средней степенью конденсации и числом хромосом от 44 до 47, без взаимных наложений или с небольшим их числом.

Для каждого случая средний показатель суммарной активности 10 ядер образующие районы хромосом (ЯОР) рассчитывался без кариотипирования хромосом в 20-40 клетках и складывался из показателей ФАРГ хромосом группы D и хромосом группы G. Уровень ФАРГ лимфоцитов периферической крови оценивался визуально, по размерам преципитатов восстановленного серебра и выражался по пятибалльной шкале в условных единицах: 0 у.е. - окраска отсутствует, 1 у.е. - окраска слабая (зерно серебра много меньше ширины хроматиды), 2 у.е. - средняя окраска (зерно серебра примерно соответствует ширине хроматиды), 3 у.е. - интенсивная окраска (зерна серебра больше ширины хроматиды). Сравнительно редко встречались более крупные Ag ЯОР, размер которых оценивался в 4 у.е. Для анализа отбирались метафазные пластинки с завершенной Ag-окраской, при этом использовались критерии, предложенные Созанским О.А. [15].

До анализа значений активности рибосомальных генов производилась оценка на нормальность распределения признаков. Сравнительная характеристика производилась при помощи критерия Манна-Уитни. Различия считались достоверными при значении p≤0,05.

Результаты. Исследуемая группа составила 98 человек, из них гонартрозом страдали 62 (63,2%) гонартрозом, 36 (36,8%) коксартрозом. Симметричность поражения наблюдалась у 64(65,3%) человек, у 34 пациента (44,7%) страдали односторонним остеоартрозом. Нами установлено, что суммарная активность рибосомных генов в исследуемой группе составила 18,6±0,9 у.е., а в контрольной группе 19,3±0,6. Различия в группах статистически достоверны (p=0,0005). Распределение признаков в исследуемой и контрольных группах не соответствовало нормальному распределению, поэтому нами были использованы методы непараметрической статистической обработки данных. Различия в группах по хромосомам группы D отсутствовали (p=0,27), что выражалось в абсолютных числах 12,3±0,7 условных единиц (у.е.) и 12,6±0,4 у.е. для исследуемой группы и группы контроля соответственно. Достоверные различия наблюдались по хромосомам группы G (p=0,01). В исследуемой группе функциональная активность равнялась 6,3±0,2 у.е., а в группе контроля 6,7±0, у.е. Также были обнаружены различия в числе рибосомальных цистронов (p=0,009); в исследуемой группе данный показатель составил 8,4±0,3, а в контрольной группе 8,1±0,3. По количеству функционально активных цистронов группы D достоверных различий не выявлено (р=0,4), что в абсолютных числах составило 4,9±0,3 и 5,1±04 для исследуемой и контрольных групп соответственно. Достоверные различия наблюдались для хромосом группы G- 4,1±0,2 для контрольной группы и 3,8±0,3 для группы больных, при p=0,008. Всех пациентов исследуемой группы мы разделили в зависимости от уровня копийности рибосомальных генов (т.е. от уровня активности рибосомальных генов). Так в исследуемой выборке преобладали пациенты 56 (57,14%) с «низкой» копийностью (уровень активности от 15,99 усл.ед. до 17,99 усл. ед.), а также пациенты со средней копийностью рибосомальных генов 27 (27,6%) - уровень активности генов от 17,99 усл. ед. до 20.99 усл. ед., что может быть индикатором снижения активной дозы рибосомальных генов при наличии заболевание опорно-двигательной сиситемы.

Выводы. Приведенные выше данные функциональной активности рибосомных у больных первичным остеоартрозом крупных суставов, отличаются от полученных данных для группы контроля. Снижение данных показателей может служить индикатором уменьшения активности белок синтезирующего аппарата хондроцитов гиалинового хряща крупных суставов, уменьшения содержания межклеточного матрикса, гипергидратации хряща и в конечном итоге образования дефектов. Значимый вклад рибосомных генов в формирование и развитие первичного остеоартроза подтверждает необходимость комплексного медико-генетического обследования пациентов с первичным остеоартрозом. Необходимо пациентам с низкой копийностью рибосомальных генов применение более ранних программ лечения и изменения характера физической активности. Необходимо исследование факторов риска развития заболевания, в комплексе с клиническими и цитогенетическими исследованиями для прогнозирования раннего развития и характера клинического течения заболевания, а также возможной эффективности консервативной терапии.

Список использованных источников:

  1. Zhang Y., Jordan J.M., Epidemiology of Osteoarthritis// Clin Geriatr Med. Aug 2010; 26 (3): 355-369.
  2. Митрофанов В.А., Жаденов И.И. Остеоартроз: факторы риска, патогенез и современная терапия// Саратовский научно-медицинский журнал, 2008. Вып. 2, т. 4. - С.23-30
  3. Корж А.А. Диагностика и консервативное лечение заболеваний и повреждений опорно-двигательной системы. - М.: Медицина, 2012.
  4. 4. Aaron R.K., Racine Pathogenesis and Epidemiology of Osteoarthritis// Rhode Island Medical Journal, March 2013, 19-22.
  5. Sokolove J., Lepus C.M. Role of inflammation in the pathogenesis of osteoarthritis: latest findings and interpretations// Ther Adv Musculoskelet Dis. Apr 2013; 5 (2): 77-94.
  6. Sandell L.J., Ainger T. Articular cartilage and changes in arthritis: Cell biology of osteoarthritis// Arthritis Reseach &Therapy 2001,3: 107-113.
  7. 7.Ляпунова Н.А., Вейко Н.Н. Ядрышкообразующие районы (ЯОР) хромосом человека: опыт количественного цитологического и молекулярного анализа// Биологические мембраны.-2001.-Т.18,№3.-С.189-199.</
  8. Lee A.S., Ellman M.B., Dongyao Y., Kroin J.S., Cole B.J., van Wijnen A.J., Im H.-J. A current review of molecular mechanisms regarding osteoarthritis and pain// Gene, 25 September 2013, Pages 440-447
  9. Stelzl U., Connell S., Nierhaus K.H., Wittmann-Liebold B., Ribosomal Proteins: Role in Ribosomal Functions. 2001.
  10. Иванов В.П., Трубникова Е.В., Бушуева О.Ю., Колчанова И.О. Особенности клинических проявлений мультифакториальных заболеваний (язвенной болезни, миомы матки, злокачественных лимфом) и модифицирующее действие рибосомных генов. Курск, 2008. 420 с.
  11. Мамаев Н.Н. Структура и функция ядрышкообразующих районов хромосом: молекулярные цитологические и клинические аспекты// Цитология.-1984.-Т.26,№1.-С.46-51
  12. Залетаева Т.А., Кулешов Н.П., Залетаев Д.В., Барцева О.Б. Современные методы хромосомного анализа в клинико-цитогенетических исследованиях. М.: Медицина, 1994. 68 с.
  13. Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы) / Под ред. А.И. Карпищенко - СПб.: Интермедика, 1997. - 304 с.
  14. Морфо-функциональные варианты ядрышкообразующих районов хромосом человека / Н.А. Ляпунова, Т.Г. Цветкова, И.А. Кравец // Первый Рос. съезд мед. генетиков: тез. докл. 1994. - С.134.
  15. Сравнительное изучение активности ядрышкообразующих районов метефазных хромосом в лимфоцитах крови и фибробластах кожи человека / О.А. Созанский, С.М. Терехов // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1983. - № 6. - С. 1-12.