Введение. Актуальность проблемы. Современная имплантология немыслима без костнопластических материалов и операций, позволяющих достичь индивидуальный, долгосрочный и стабильный результат.
Трансплантационный материал играет роль строительного каркаса, который позволяет организму медленно заместить пространство новообразованной родной костной тканью с дальнейшим ее дифференцированием (остеокондукция), или же стимулирует образование новой костной ткани путем прямой стимуляции процесса трансформации недифференцированных мезенхимальных клеток в остеобласты (остеоиндукция) [1, 2].
При проведении манипуляций с применением костнопластических материалов «золотым стандартом» аугментации считаются аллотрансплантаты. Как правило, это промышленно очищенная и подготовленная трупная кость, находящаяся в стерильном виде и доступная в любых количествах. Наиболее часто используемая и наиболее безопасная форма подобного рода материалов - это лиофилизированная кость и деминерализованная лиофилизированная кость, которые обладают индуктивными и кондуктивными свойствами одновременно. Производством таких материалов занимаются некоторые сертифицированные лаборатории (банки тканей), в частности Институт Экспериментальной медицины и Биотехнологий и Банк Тканей Самарского Государственного Медицинского Университета, ООО «Лиоселл».
Забор донорской кости должен производиться под строгим контролем от тщательно подобранных доноров, свободных от любой контагиозной патологии [3].
Для реализации персонифицированного подхода в лечении пациентов с различными костными дефектами необходимо максимально учитывать и воссоздавать их индивидуальные особенности, что стало возможным с применением высоких технологий на основе трехмерного моделирования [4].
С появлением цифрового прототипирования и развитием аддитивных технологий в медицине стало возможным изготовление индивидуальных эндоимплантатов путем 3D-фрезерования костных блоков на станках с числовым программным управлением (ЧПУ). Эти станки позволяют обеспечить высокую точность объектов, изготавливаемых в соответствии с загруженной цифровой 3D-моделью будущей формы имплантата, которая заблаговременно тщательно моделируется соответственно геометрии костного дефекта [5-7].
При этом полученный персонифицированный костный имплантат должен отвечать важнейшему из требований, предъявляемых к материалам медицинского назначения - быть биологически совместимым с организмом человека [8, 9].
До клинических испытаний биоматериал должен пройти несколько стадий отбора, одной из которых является оценка на цитотоксичность в соответствии с ГОСТ ISO 10993.5-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий», ч. 5 [10].
В частности, in vitro тестирование проводят путем инкубации клеточной культуры (фибробластов, моноцитов, лимфоцитов и др.) непосредственно в контакте с изделием [11]. Культуры клеток представляют собой генетически однородную популяцию клеток, растущих в постоянных условиях. Наличие цитотоксичности определяют по следующим изменениям - нарушение картины общей морфологии, вакуолизация, лизис клеток и нарушение целостности мембран, увеличение количества погибших клеток, снижение пролиферации клеток и образования колоний.
Эти эксперименты легко воспроизводимы и позволяют получать существенные результаты при использовании очень небольшого числа клеток, что снимает многие этические проблемы, возникающие при необходимости использовать для эксперимента большую группу животных.
Существуют исследования степени набухания индивидуальных трехмерных конструкций для восстановления челюстно-лицевых костных дефектов, изготовленных из биокомпозиционного материала, на стереолитических моделях [6].
Имеются данные об изучении цитотоксичности различных материалов (биокомпозитов, металлов) на жизнеспособность и полиферативную активность клеток in vitro [12, 13].
Однако мы не встретили в современной литературе данных об изучении цитотоксичности аллогенных деминерализованных лиофилизированных имплантатов, прошедших впоследствии фрезерную обработку на станке с ЧПУ в целях придания им точной индивидуальной формы костного дефекта реципиента.
Ввиду вышеперечисленного в данной работе нами было решено протестировать изготовленные нами образцы персонифицированных костных имплантатов на культуре остеогенных фибробластоподобных клеток человека.
Цель работы. Провести доклинические испытания персонифицированных костных имплантатов с применением культур остеогенных фибробластоподобных клеток человека и дать оценку биосовместимости и цитотоксичности при применении различных технологий обработки первичной биозаготовки.
Материалы и методы исследований. В рамках доклинических испытаний разработанные и изготовленные нами образцы персонифицированных костных имплантатов мы подвергли комплексным исследованиям, направленным на изучение их биосовместимости. В качестве одной из тест-систем мы выбрали культуру клеток, в частности, культуру остеогенных фибробластоподобных клеток человека.
Для проведения исследования биосовместимости и цитотоксичности, мы выделили две группы персонифицированных костных имплантатов (по 30 опытных образцов в каждой):
Опытные образцы персонифицированных костных имплантатов из матриц губчатого слоя нативной кости, прошедших обезжиривание и фрезерную обработку;
Опытные образцы персонифицированных костных имплантатов из матриц губчатого слоя нативной кости, прошедших обезжиривание, лиофилизацию и фрезерную обработку.
Остеогенные фибробластоподобные клетки выращивали из крыши черепа абортированного эмбриона 12-й недели гестации по стандартной методике. Клетки культивировали в стандартных условиях в СО²-инкубаторе Sanyo-Incubator MIR-262 («Sanyo», Япония) при температуре 37°С и постоянной влажности и 5% СО² в среде МЕМ (ООО «БиолоТ», Санкт-Петербург, РФ) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ООО «БиолоТ», Санкт-Петербург, РФ).
Наличие инфекционных агентов (цитомегаловирус, вирусы гепатитов В и С, уреаплазма, хламидии trachomatis, микоплазмa hominis, вирус папилломы человека высокого канцерогенного риска (14 типов), вирус герпеса 1 и 2 типа, грибы рода Candida albicans) в клеточном материале определяли методом ПЦР на 4-м пассаже. Результаты всех анализов были отрицательные. Идентификацию клеток на 4 пассаже проводили с использованием морфологических и биохимических методов и проточной цитометрии.
Контрольная группа культуры остеогенных фибробластоподобных клеток человека имела следующие морфофункциональные характеристики.
Остеогенные клетки 4 пассажа, выращенные из крыши черепа эмбриона, в нативной культуре имели вытянутую форму, 2-5 отростков, гомогенную цитоплазму, в то же время их поперечные размеры превышали размеры фибробластов. Границы клеток четкие. Ядра овальной формы, расположены обычно в центральной зоне тел клеток, содержали 1-2 ядрышка. Адгезия к культуральному пластику хорошо выражена: через 2 часа после пересева большая часть их приставала ко дну культуральной посуды и распластывалась по нему. Через сутки клетки формировали неполный равномерный монослой, в котором клетки соединены своими отростками (рис. 1).
Рис. 1. Нативная культура остеогенных фибробластоподобных клеток человека, 4 пассаж. 1 сутки после пересева. Инвертированный микроскоп, х100.
На третьи сутки количество клеток увеличивалось, отростками клетки соединялись друг с другом (рис. 2). В дальнейшем клетки росли, увеличиваясь в количестве, и формируя равномерный монослой.
Рис. 2. Нативная культура остеогенных фибробластоподобных клеток человека, 4 пассаж. 3 сутки после пересева. Инвертированный микроскоп, х100.
Остеобласты в культуре не образовывали характерных для фибробластов «завитков», они росли массивными продольно располагающимися пластами. На 6 сутки образовывали полный монослой, а на 7 сутки достигали плотности насыщения (рис. 3) и переходили в стационарную фазу роста.
Рис. 3. Нативная культура остеогенных фибробластоподобных клеток человека, 4 пассаж. 7 сутки после пересева. Инвертированный микроскоп, х100.
Способность к образованию колоний у клеток данной культуры отсутствовала. Все это позволило отнести такие клетки к фибробластоподобным.
При окраске гематоксилин+судан IV через 7 суток после пересева было видно, что у большинства остеогенных фибробластоподобных клеток из крыши черепа эмбриона уменьшались продольные размеры и относительно увеличивались поперечные, в связи с чем клетки приобретали форму, приближающуюся к ромбовидной. Цитолемма была ровной, цитоплазма слабо оксифильна и представлялась гомогенной. Ядра правильной овальной формы, с гладкой оболочкой, хроматин в виде мелкой зернистости расположен в ядрах диффузно; нейтральный жир в цитоплазме не обнаруживали, что свидетельствовало о низкой степени дифференцировки этих клеток (рис. 4). Отростки клеток разной толщины и формы, имели гладкие ровные контуры и небольшую длину, анастомозировали с отростками соседних клеток.
Рис. 4. Культура остеогенных фибробластоподобных клеток человека. 4 пассаж. Монослой, 7 суток после пересева. Окраска судан IV + гематоксилин, х200.
Исследование биосовместимости опытных образцов персонифицированных костных имплантатов осуществляли методом прямого контакта в аналогичных условиях культивирования клеток.
Все работы с культурой проводили в ламинарном боксе БАВп-01 «Ламинар-С» (ЗАО «Ламинарные системы», Миасс, РФ). На дно чашек Петри помещали образцы материала. Клетки культуры снимали со дна культурального флакона стандартным способом (при помощи 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена) и отмывали центрифугированием в течение 5 минут при 1500 оборотов в стерильной центрифужной пробирке в ростовой среде, содержащей 5% сыворотки плодов коровы. Количество клеток считали в камере Горяева, еще раз центрифугировали, и осадок ресуспендировали в ростовой среде, после чего полученную суспензию переносили на тестируемые образцы, помещенные в чашки Петри.
Контролем служили планшеты с культурой соответствующих клеток без образцов, которые пассировали и наблюдали одновременно с экспериментальными. При посеве доза во всех случаях составляла 20 тысяч клеток/см². Ежедневное наблюдение за культурой клеток вели в течение 7 дней: на 1-е, 3-и 7-е сутки. Всего было проведено 80 исследований - 60 опытов и 20 контрольных наблюдений.
Для изучения, фотографирования и морфометрирования нативных культур мы применяли инвертированный микроскоп «Биолам-2-1» при увеличении 63 и 100 (окуляры - 6,3 и 10, объектив - 10). Оценивали: целостность монослоя; плотность клеток монослоя на единицу площади и количество поврежденных клеток (на 200 клеток) - с помощью окулярной сетки Автандилова; наличие и количество слущенных клеток в культуральной жидкости и соотношение живых и мертвых клеток (при пересеве) - с помощью камеры Горяева; форму и размеры клеток, структуру клеток (состояние цитоплазмы - наличие вакуолей, зернистости, наличие и состояние отростков, структуру ядра и ядрышек, положение ядра в клетке, количество ядер и ядрышек в клетках).
По окончании каждого срока эксперимента готовили гистологические препараты клеточных культур. Ростовую среду из чашек удаляли, а клетки окрашивали гематоксилином и суданом IV. Препараты изучали и фотографировали с помощью автоматизированной аналитической системы, включающей микроскоп «Olympus CX 21», цифровую фотокамеру «Olympus» С-4000 ZOOM и системный блок на базе процессора Intel Pentium 4. Всего изучено 180 опытных и 60 контрольных препаратов.
Результаты и обсуждение. Результаты тестирования опытных образцов персонифицированных костных имплантатов из матриц губчатого слоя нативной кости, прошедших обезжиривание и фрезерную обработку (1 группа).
Через сутки от начала эксперимента наблюдали, что клетки начинали приставать к культуральному флакону. Были обнаружены также неприкрепившиеся клетки, имеющие округлую форму (рис. 5).
На 3 сутки количество клеток как вблизи помещенного образца, так и в отдаленных зонах постепенно увеличивались в количестве. Форма и размеры клеток сохранялись (рис. 6).
На 7 сутки эксперимента клетки начинали формировать монослой. Форма клеток не отличалась от контрольной группы (рис. 7).
Рис. 5. Нативная культура остеогенных фибробластоподобных клеток, нанесенная в суспензии на имплантат. Инвертированный микроскоп. 1-е сутки эксперимента, х100.
Рис. 6. Нативная культура остеогенных фибробластоподобных клеток, нанесенная в суспензии на имплантат. Инвертированный микроскоп. 3- е сутки эксперимента, х100.
Рис. 7. Нативная культура остеогенных фибробластоподобных клеток, нанесенная в суспензии на имплантат. Инвертированный микроскоп. 7- е сутки эксперимента, х100.
На 7 сутки при окраске гематоксилин + судан IV остеогенные фибробластоподобные клетки в непосредственной близости от образца были расположены в разных направлениях. Клетки удлиненной формы, отростки имели четкие контуры. Цитоплазма клеток оксифильна и представлялась гомогенной. Ядра правильной формы, с гладкой оболочкой, хроматин в виде мелкой зернистости расположен в ядрах диффузно. Нейтрального жира в клетках не обнаруживали (рис. 8).
Рис. 8. Культура остеогенных фибробластоподобных клеток человека вблизи имплантата. Окраска гематоксилин + судан IV, х200.
Результаты тестирования опытных образцов персонифицированных костных имплантатов из матриц губчатого слоя нативной кости, прошедших обезжиривание, лиофилизацию и фрезерную обработку (2 группа).
В первые сутки эксперимента клетки начинали приставать как ко дну культурального флакона, так и к поверхности помещенного образца, единичные нерасправленные клетки имели округлую форму. Прикрепленные к пластику клетки сохраняли форму и размер 3-4 отростка (рис. 9).
Рис. 9. Нативная культура остеогенных фибробластоподобных клеток нанесенных в суспензии на имплантат. Инвертированный микроскоп. 1- е сутки эксперимента, х100.
На 3 день отмечали увеличение клеток. Клетки соединены между собой отростками. Клетки сохраняли свою форму и размер как в непосредственной близости от образца, так и в отдаленных от него участках. Цитоплазма гомогенная, границы клеток хорошо очерчены. Отростки хорошо просматривались (рис. 10).
Рис. 10. Нативная культура остеогенных фибробластоподобных клеток нанесенных в суспензии на имплантат. Инвертированный микроскоп. 3- е сутки эксперимента, х200.
На 7 день эксперимента сформирован плотный монослой. Клетки плотно прилежали друг к другу (рис. 11).
Рис. 11. Нативная культура остеогенных фибробластоподобных клеток нанесенных в суспензии имплантат. Инвертированный микроскоп. 7- е сутки эксперимента, х100.
При обзорных окрасках судан IV+ гематоксилин на 7 сутки эксперимента клетки вытянутой формы. Цитоплазма несколько вакуолизирована, слабо оксифильна. Клетки соединялись между собой отростками. Отростки хорошо видны. Ядра правильной округлой формы с гладкой оболочкой, располагались преимущественно в центре. Хроматин в виде мелкой зернистости расположен в ядрах диффузно. При окраске гематоксилин + судан IV нейтральный жир не обнаруживали (рис. 12).
Рис. 12. Культура остеогенных фибробластоподобных клеток человека, вблизи имплантата. 7 суток эксперимента. Окраска гематоксилин + судан IV, х200.
Заключение. В результате проведенных доклинических испытаний персонифицированных костных имплантатов с применением культур остеогенных фибробластоподобных клеток человека уставлено отсутствие цитотоксического эффекта у полученных опытных образцов. Изменение технологии обработки первичной биозаготовки за счет введения фрезерования на станке с программным числовым управлением не приводит к снижению высокой степени биосовместимости полученных персонифицированных костных имплантатов.