Введение. Современное развитие реконструктивной хирургии мягких тканей невозможно представить без использования специализированных эндопротезов. Применение эндопротезов из синтетических материалов стало переворотом в герниологии и реконструктивной хирургии тазового дна. В 1984 г. I. Lichtenstein и P. Amid сформулировали концепцию «ненатяжной герниопластики» с применением синтетического сетчатого эндопротеза из монофиламентного полипропилена и предложил подобный подход в качестве операции первой линии даже для лечения «стандартных» паховых грыж [1]. Десятилетие спустя P. Petros и U. Ulmsten (1995) предложили инновационную методику лечения недержания мочи при напряжении с использованием синтетической полипропиленовой ленты, ставшую золотым стандартом [2]. Через год T. Julian (1996) представил свои результаты применения полипропиленовой сетки Marlex в хирургическом лечении тяжелых и рецидивных форм цистоцеле [3]. Данная работа положила начало большой серии клинических исследований, в которых авторы применяли различные синтетические сетки в хирургическом лечении цистоцеле и ректоцеле.
Ежегодно в мире производится около 1 миллиона имплантаций сетчатых протезов [4]. В некоторых странах более 90% всех оперативных вмешательств по поводу грыж, пролапса тазовых органов и недержания мочи выполняется с использованием синтетических эндопротезов [5, 6]. К сожалению, существующие образцы имплантатов не лишены недостатков, а процессы, сопровождающие внедрение такого чужеродного агента, как синтетический протез, имеют свои отличительные особенности.
Цель работы: изучить реакцию тканей на имплантацию синтетических протезов различной структуры, химического состава и технологий производства.
Материалы и методы. Для анализа были взяты шесть образцов современных синтетических сетчатых материалов, имеющих выраженные отличия в структуре, химическом составе и технологии производства. Среди исследуемых изделий были представлены эндопротезы, выполненные из монофиламентного полипропилена (ПП) трех различных диаметров – Эсфил стандартный, Эсфил легкий, Эсфил сверхлегкий; монофиламентного поливинилиденфторида (ПВДФ) – Унифлекс; смеси монофиламентных ПП и ПВДФ – Флексилен; смеси монофиламентных ПП и полиглекапрона (ПГК) – Ультрапро.
Исследование осуществлялось с применением следующего оборудования: микроскоп Axioskop-40 (Carl Zeiss), оснащенный цифровой системой анализа изображения ВидеоТест.
Исследования проводились на базе клиники экспериментальных животных № 2 Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова и кафедры оперативной хирургии Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова. В эксперименте было задействовано 54 кролика породы «Шиншилла» обоих полов в возрасте 1 – 1,5 года, весом 3000 – 3500 г. Животные были разделены на шесть равных опытных групп (в соответствии с числом исследуемых образцов эндопротезов), в каждой из которых было 9 кроликов. Опытные группы, в свою очередь, разделялись на три подгруппы по 3 животных (в соответствии со сроком имплантации синтетического сетчатого материала – 7, 30 и 90 суток). Животные содержались в одинаковых условиях при стандартном пищевом режиме. Основные этапы исследования включали: «введение» животных в эксперимент; экспозиция и наблюдение на протяжении срока имплантации эндопротеза (7, 30 и 90 суток); «выведение» животных из эксперимента и забор материала; морфологическая и морфометрическая оценка реакции тканей животного на имплантацию эндопротеза.
Оперативные вмешательства были проведены в асептических условиях под общей анестезией с использованием комбинации препаратов Золетил 50 и Ксила. После введения животного в наркоз после обработки операционного поля по средней линии живота в продольном направлении рассекалась кожа и подкожная клетчатка длинной 4 – 5 см, отступя книзу от мечевидного отростка на 2 см. Далее передняя стенка влагалища (апоневроза) прямых мышц освобождались от клетчатки путем ее отсепаровки в стороны от срединного разреза на расстояние 2,5 - 3 см. В созданное таким образом пространство («ложе») помещался эндопротез и фиксировался к апоневрозу прямых мышц живота узловыми швами по периферии нитью на атравматической игле. Эндопротезы фиксировали полипропиленовой мононитью 3/0.
Для гистологического исследования подготавливалось 3 гистологические заготовки: одна с сеткой (либо боковая правая, либо боковая левую, либо верхняя, либо нижняя), две с мышцами (одна любая боковая и одна верхняя, либо одна нижняя).
После стандартной обработки, заключающейся в фиксации в 10 % растворе нейтрального формалина и обезвоживании в спиртах возрастающей крепости от 70% до 96%, образцы заливали в парафин, а из парафиновых блоков на микротоме изготовлялись срезы, которые окрашивали гематоксилин – эозином и по Ван-Гизон.
Полученные препараты оценивали по стандартным гистологическим критериям с подробным описанием кожного лоскута, мышечной оболочки и реакции на сетку. Затем гистологические срезы фотографировали с помощью микроскопа Axioskop 40 и цифровой фотокамеры. Морфометрический анализ осуществлялся в программе Видео-тест – Морфология 5.2.
Результаты и обсуждение. К 7 суткам в брюшной стенке животных определяются три сформированные зоны, расположенные по направлению от имплантированной сетки к здоровым тканям (мышцы с одной стороны, кожа - с другой). Первая зона представлена, экссудативной реакцией, аморфными массами и слабой диффузной инфильтрацией нейтрофильными лейкоцитами, макрофагами, плазматическими клетками и лимфоцитами, вторая – зона отека и третья зона – грануляционная ткань с новообразованными сосудами. Первые две зоны плавно переходят одна в другую так, что четкой границы между ними выявить не представляется возможным. Третья зона во всех исследуемых образцах представляет либо очаги грануляционной ткани вдоль мышц, либо узкую полоску расположенную рядом с мышами. Между исследуемыми сетками можно отметить следующие гистологические отличия. Реакция на сетки Эсфил несколько более замедленная, чем на другие (особенно это касается эндопротеза Эсфил стандартный). На 7 сутки в образцах тканей с сетками Эсфил фибрин ещё лежит в виде нитей, не распадается, нейтрофильные лейкоциты только начинают инфильтрировать фибрин. Грануляционная ткань представлена только очаговыми скоплениями новообразованных сосудов и клеток, либо в виде узкой зоны. В остальных образцах уже идет активный процесс формирования грануляционной ткани.
Результаты морфометрического анализа тканей на 7 сутки представлены в табл. 1. Наибольшее количество нейтрофильных лейкоцитов определялось в образцах с эндопротезами Эсфил стандартный и Эсфил легкий, чуть меньше клеток было обнаружено в инфильтрате вокруг сетки Эсфил сверхлегкий. Достоверных отличий между этими группами не выявлено. Математический анализ показал, что количество нейтрофильных лейкоцитов в клеточном инфильтрате вокруг Эсфила стандартного достоверно больше, чем вокруг сетки Ультрапро (p<0,0001), Унифлекс (p<0,0001) и Флексилен (p<0,0001). Количество нейтрофильных лейкоцитов вокруг сетки Эсфил легкий достоверно больше, чем вокруг сеток Ультрапро (p=0,002), Унифлекс (p=0,026) и Флексилен (p<0,0001). Число лимфоцитов в клеточном инфильтрате вокруг сетки Эсфил стандартный достоверно меньше, чем в случае Эсфила легкого (p=0,024) и Эсфила сверхолегкого (p=0,004). Оценка количества лимфоцитов в клеточном инфильтрате на сетку Эсфил стандартный не выявила достоверных отличий от данных, полученных при анализе сеток Ультрапро, Унифлекс и Флексилен. Анализ клеточного состава грануляционной ткани показывает, что реакция на нити сетки Эсфил стандартный ниже, чем в сравниваемых сетках. Количество сосудов и фибробластов в инфильтрате минимальное, т.е. меньше, чем в других сетках, следовательно, грануляционная ткань только начинает образовываться к 7 суткам. Количество сосудов в клеточном инфильтрате на Эсфил стандартный достоверно меньше, чем в инфильтрате на Эсфил сверхлегкий (p=0,001) и Унифлекс(p=0,002).
Таблица 1. Результаты морфометрического анализа на 7 сутки
Измерения толщины зоны экссудативной реакции, клеточной инфильтрации и формирующейся грануляционной ткани трех видов сеток Эсфил: стандартный, легкий и сверхлегкий выявило, что реакция на сетки Эсфил сверхлегкий достоверно более выражена (толщина экссудативной реакции и грануляционной ткани больше), чем на Эсфил стандартный и Эсфил легкий как в области узлов, так и в области протяжек (p<0,001). Анализируемые показатели в сетках Эсфил стандартный и Эсфил легкий достоверно не отличается. В полурассасывающихся сетках Ультрапро толщина зоны клеточного инфильтрата, экссудативной реакции и грануляционной ткани приближается к таковой на сетку Эсфил сверхлегкий, однако в области узлов зона реактивных изменений достоверно больше в сетке Эсфил сверхлегкий (p<0,0001). Эсфил стандартный и Эсфил легкий обеспечивают достоверно меньший, чем на сетку Ультрапро объем реактивных изменений в области узлов и протяжек.
На 30 сутки можно увидеть характерную гистологическую картину вокруг сетчатых имплантов - это два типа соединительной ткани: зрелая – на периферии, рыхлая – в центральной части, т.е. вокруг сетки. Непосредственно вокруг нитей сеток определяются макрофаги и гигантские клетки инородных тел. В сетках Ультрапро выявляются скопления макрофагов по типу макрофагальных гранулём в области рассасывающегося компонента – монокрил. При морфометрическом анализе на 30 сутки количественное соотношение клеток изменилось по сравнению с 7 сутками. Увеличилось количество макрофагов и гигантских клеток инородных тел, количество нейтрофильных лейкоцитов значительно уменьшилось (табл. 2).
Таблица 2. Результаты морфометрического анализа на 30 сутки
Анализ числа нейтрофильных лейкоцитов выявил минимальное число клеток в инфильтрате на все исследуемые сетки, практическое отсутствие этих клеток в клеточном инфильтрате на сетку Флексилен и полное отсутствие различий в количестве клеток в клеточном инфильтрате всех исследуемых сеток (достоверных отличий нет).
Среднее количество макрофагов между различными сетками различалось почти в 3 раза (Эсфил стандартный – 7,0±1,8 и 19,7±1,9 – Ультрапро). Количество макрофагов в клеточном инфильтрате полу рассасывающейся сетки Ультрапро достоверно больше, макрофагов в инфильтрате окружающем нити сетки Эсфил стандартный (p<0,0001), Эсфил сверхлегкий (p<0,0001) и Унифлекс (p<0,0001). Достоверные отличия определяются и при анализе макрофагов, окружающих сетку Флексилен, макрофагов больше чем вокруг сетки Эсфил стандартный (p=0,004), Эсфил сверхлегкий (p<0,001) и Унифлекс (p=0,004). Определяется большое количество макрофагов и в инфильтрате вокруг сетки Эсфил легкий. Этих клеток достоверно больше чем в инфильтрате Эсфил стандартный (p=0,033), Эсфил сверхлегкий (p=0,011) и Унифлекс (p=0,038).
Анализ количества клеток иммунной системы: лимфоцитов и плазматических клеток показал, что на рассасывающийся компонент сетки Ультрапро имеется выраженная реакция. Увеличение количества этих клеток в инфильтрате вокруг сетки, их достоверно большее количество, чем в других исследуемых сетках (лимфоциты - p<0,0001 для всех сеток, плазматические клетки - p<0,05, кроме сетки Унифлекс) свидетельствует о значительных реакциях иммунной системы на сетку Ультрапро. Количество лимфоцитов в инфильтрате вокруг сетки Эсфил легкий было больше аналогичного показателя у других сеток, однако достоверные отличия выявлены только с сеткой Эсфил сверхлегкий (p=0,003). Клеточный инфильтрат в соединительной ткани вокруг сетки Ультрпро содержал лимфоцитов почти в два раза больше, чем в сетке Эсфил легкий. Значительно больше плазматических клеток в клеточном инфильтрате, образовавшемся вокруг сетки Ультрапро.
Во всех типах сеток на 30 сутки продолжаются процессы пролиферации, т.е. процесс образования соединительной ткани и её ремодуляция. Количество фибробластов и фиброцитов в соединительной ткани, образовавшейся вокруг сеток Эсфил стандартный и Эсфил легкий, приблизительно одинаковое и средние данные достоверно не отличаются. В соединительной ткани образовавшейся вокруг сетки Эсфил сверхлегкий наименьшее количество фибробластов и фиброцитов. Достоверные отличия регистрируются с сеткой Эсфил стандартный (фибробласты - p<0,0001, фиброциты - p<0,013), Эсфил легкий (фиброциты - p<0,0001), Ультрапро (фибробласты - p<0,0001) и Флексилен (фибробласты - p<0,0001).
При сравнение сеток Эсфил выявлены достоверные отличия в толщине соединительной ткани. Так, средние значения толщины соединительной ткани в группе Эсфил стандартный достоверно выше, чем в группе Эсфила легкого (узлы - p<0,0001, протяжки - p<0,001), Эсфила сверхлегкого (узлы - p<0,01, протяжки - p<0,0001), Ультрапро (узлы - p<0,0001, протяжки - p<0,001) и Флексилена (узлы - p<0,0001). Полурассасывающаяся сетка Ультрпро отличается от всех остальных самой тонкой соединительной тканью, образовавшейся вокруг сетки. Все сравнения высоко достоверны (p<0,0001), кроме сетки Эсфил легкий в области протяжек p<0,05. Сетка Унифлекс окружена самой толстой соединительнотканной капсулой. Достоверных отличий нет только в области протяжек с сеткой Эсфил стандартный и в области узлов с сетками Эсфил сверхлегкий и Флексилен. Остальные сетки демонстрируют достоверно меньшие показатели толщины образовавшейся вокруг них соединительной ткани (достоверность колеблется от p<0,01 до p<0,0001).
На 90 сутки практически заканчиваются процессы распознавания и рассасывания распадающихся компонентов сеток, соединительная ткань образовалась и оформилась в виде вытянутых волокон. Процессы пролиферации соединительной ткани представлены слабо.
Данные морфометрического анализа представлены в табл. 3.
Таблица 3. Результаты морфометрического анализа на 90 сутки
Оценка количества нейтрофильных лейкоцитов на 90 сутки показала наличие единичных клеток в инфильтрате вокруг сетки и полное отсутствие достоверных отличий. Аналогичная картина была обнаружена и на 30 сутки.
Количество макрофагов на 90 сутки изменилось. Так, в инфильтратах сеток Эсфил стандартный и Эсфил сверхлегкий и Унифлекс количество макрофагов увеличилось. Эсфил легкий – цифры значений макрофагов в клеточном инфильтрате остались высокими – самыми высокими в исследованных группах. В инфильтратах сеток Ультрапро и Флексилен средние значения количества макрофагов стали значительно ниже. Достоверные отличия были выявлены между сетками Эсфил легкий и Ультрапро (p<0,009), Эсфил легкий и Флексилен (p=0,002).
Анализ реакции иммунной системы показал, что значительное снижение количества исследуемых клеток произошло к 90 суткам только в сетке Ультрапро, в других сетках этих изменений не отмечается. Достоверных отличий в количестве лимфоцитов и плазматических клеток в инфильтратах исследуемых клеток нет.
Количество фибробластов и фиброцитов в соединительной ткани к 90 суткам достигло оптимальных значений, достоверных отличий между исследуемыми сетками не обнаружено. В соединительной ткани вокруг таких сеток как Эсфил стандартный, Ультрапро и Урослинг фибробластов и фиброцитов стало несколько меньше, а в сетке Эсфил сверхлегкий – больше. Достоверных отличий не выявлено в отношении количества новообразованных сосудов соединительной ткани.
На 90 сутки эксперимента соединительнотканная капсула, окружающая сетки стала значительно тоньше. Средние значения толщины соединительной ткани в группе Эсфил стандартный достоверно выше, чем Эсфил легкий (протяжки - p<0,005) и Эсфил сверхлегкий (узлы - p<0,0001, протяжки - p<0,0001), Ультрапро (узлы - p<0,03), Унифлекс (протяжки - p<0,05) и Флексилен (узлы - p<0,0001 и протяжки - p<0,0001).
Наименьшие средние значения толщины соединительнотканной капсулы определяются на сетку Эсфил сверхлегкий (при сравнении данных с другими группами во всех исследованиях отличия достоверные (узлы и протяжки - p<0,0001)).
Выводы
Данные, полученные в результате морфологического и морфометрического исследования, позволяют сформулировать следующие выводы:
1. Реакция тканей на все виды эндопротезов в целом носила типовой характер с некоторыми особенностями, которые определялись отличиями в физико-химической природе сеток.
2. На раннем сроке (7 суток) наиболее сбалансированная реакция наблюдалась на эндопротезы Унифлекс: раньше, чем у прочих образцов заканчивалась нейтрофильная фаза клеточного ответа и начиналась макрофагальная с последующим формированием грануляций. При этом быстро разрушались фибриновые отложения, отек тканей был незначительным, что указывает на минимальный риск возникновения сером при использовании этого типа имплантов.
3. На средних сроках (30 суток) полурассасывающиеся эндопротезы Ультрапро вызвали достоверно самую выраженную сенсибилизацию окружающих тканей с формированием значительных по площади клеточных инфильтратов, состоящих макрофагов, гигантских клеток инородных тел, плазмоцитов. При этом наблюдался выраженных отек тканей. Все эти негативные изменения были вызваны деструкцией рассасывающихся полигликолидных нитей.
4. На отдаленных сроках (90 суток) картина тканевой реакции на все типы эндопротезов не имела значимых отличий – происходило «выравнивание» всех показателей. При этом достоверно наиболее тонкая рубцовая ткань образовывалась вокруг эндопротеза с самой низкой материалоемкостью – Эсфил суперлегкий.
5. Наилучшее функциональное состояние окружающих мышц (отсутствие атрофии) наблюдалось у животных с имплантированным эндопротезом Эсфил суперлегкий.
6. Никаких значимых отличий в реакции ткани на эндопротезы с «большой ячейкой» (Ультрапро) и «малой ячейкой» (Эсфил и Унифлекс) обнаружено не было. Характер васкуляризации и фиброзирования окружающих тканей был абсолютно схожим.
7. Среди эндопротезов семейства Эсфил, выполненных из монофиламентного полипропилена разных диаметров, наблюдались довольно заметные разнонаправленные отличия в тканевой реакции на ранних и средних сроках, что косвенно может указывать на некоторые различия в химической природе использованного для производства сырья.