Моделирование гнойной раны мягких тканей «кожно-лоскутным» методом в эксперименте

Кыргызский государственный медицинский институт переподготовки и повышения квалификации, г. Бишкек, Кыргызская Республика

Национальный хирургический центр, г. Бишкек, Кыргызская Республика

Актуальность. В течение последних десятилетий методы лечения гнойных ран неоднократно подвергались пересмотру. Это обусловлено ростом числа гнойно-воспалительных заболеваний и послеоперационных гнойных осложнений [1, 2]. Оценка морфологических изменений, протекающих в тканях при заживлении ран, представляет значительный интерес, так как обоснование результатов при использовании различных препаратов в лечении гнойных ран имеет большое значение в хирургической практике. Для оптимизации лечения гнойных ран создаются их модели [3]. В настоящее время известно много различных способов моделирования гнойных ран. Основной задачей при моделировании гнойных ран мягких тканей в эксперименте на животных является точное воспроизведение модели, приближенной к характеристикам незаживающего дефекта [4]. В начале работы нами были рассмотрены представленные ранее некоторые модели инфицированного повреждения кожи и подлежащих тканей. Способ моделирования инфицированной раны мягких тканей, предложенный одним автором заключается в следующем: под общим обезболиванием, половозрелым кроликам на спину накладывают пластину, внутри которой выполнено отверстие диаметром 2,0 см [5]. В отверстие вытягивают шкуру в виде конуса высотой 0,9-1,1 см и его иссекают. Наложением на рану на 3-5 секунд марлевого тампона, смоченного в 70% растворе уксусной кислоты, формируют очаг некроза. После удаления некротического струпа через 3-5 суток рану орошают культурой St. aureus в концентрации 5×105 КОЕ.

При моделировании гнойной раны по способу предложенным другим автором, на область планируемого разреза накладывается трафарет округлой формы диаметром 5 см [6]. По трафарету отмечают контуры раны. По намеченному контуру наносится резаная рана. Последовательно рассекается кожа и подкожно-жировая клетчатка, фасция и мышцы. Образовавшийся лоскут подшивается к поверхности раневого дефекта шерстью вниз узловыми швами.

Однако указанные методы имеют следующие недостатки. В первом случае это смешанный характер повреждения, то есть химический ожог с бактериальной обсемененностью, и раннее закрытие раневой поверхности из-за отсутствия фиксации краев раны, не позволяющие стандартизировать течение и процесс заживления. Во втором случае - распространение инфекции в свободное пространство между узловыми швами с образованием флегмон и абсцессов, а также распространение инфекции вглубь мышечной ткани за счет вскрытия мышечной фасции.

Цель исследования - изучить эффективность предложенного «кожно-лоскутного» метода при моделировании гнойной раны мягких тканей в эксперименте на животных.

Материалы и методы. Данная работа выполнена на базе Проблемной научно-исследовательской лаборатории клинической и экспериментальной хирургии Национального хирургического центра. Все животные находились в одинаковых условиях, на стандартном рационе со свободным доступом к пище и воде, в соответствии с нормативами ГОСТ «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ» 1978 г.

Опыты выполнялись в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP) (приказ № 708 от 23 августа 2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики»), правилами гуманного обращения с животными, регламентированные «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных Приказом МЗ СССР №742 от 13.11.84 г. «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», а также на основании положений Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации 1964 г., дополненной в 1975, 1983, 1989 г.

Все оперативные вмешательства проводились под общим наркозом с соблюдением правил асептики и антисептики.

Исследование было проведено на 48 беспородных разнополых кроликах весом 3,5-4,0 кг. У всех экспериментальных кроликов моделировали гнойную рану мягких тканей. Животные были разделены на 2 группы. В контрольной группе (n=24), после моделирования раны лечение не проводилось. В основной группе (n=24) лечение гнойной раны проводили с помощью антисептика Повидон-йод. Ежедневно проводились перевязки. На 3, 7, 15 и 20 день лечения проводили оценку течения раневого процесса. Для оценки характера заживления и течения раневого процесса у всех животных были проведены цитологические, бактериологические, гистологические, планиметрические и инструментальные методы исследования смоделированной раны.

Планиметрическое исследование проводили по методу, предложенному автором в разные сроки лечения, для контроля динамики заживления раны, и, используя формулу, вычисляли процент уменьшения раны за сутки [7]:

(S - Sn) x 100 / S x t,

где S - величина площади раны (мм2) при предыдущем измерении;

Sn - величина площади раны (мм2) при данном измерении;

t - число дней между измерениями.

Оценку цитологического исследования проводили на основании цитологической картины отпечатков из разных участков ран по методике авторов [8].

Мазок окрашивали по обычной гистологической методике в течение 30 минут [9].

Забор для гистологического исследования осуществляли с краёв раны с подлежащими мягкими тканями на 3, 7, 15 и 20 сутки течения раневого процесса. Материал фиксировали в 10% растворе формалина. Далее в лаборатории их проводили через спирты, после чего заливали парафином. Срезы из парафиновых блоков получали с помощью микротома. Окрашивание материала проводили раствором гематоксилина и эозина. При этом обязательно учитывали характер и степень выраженности воспалительного инфильтрата.

Моделирование обширной гнойной раны у экспериментальных животных выполнялось следующим образом (Рационализаторское предложение № 832 от 10 мая 2016 г.). Через 5 мин после введения животных в медикаментозный сон препаратом Кетамин, внутривенно из расчета 7 мг/кг веса, животное фиксировали в положение на животе. После подготовки операционного поля по трафарету диаметром 5,0 см, выполненному из листа рентгеновской пленки, на область планируемого разреза 1% спиртовым раствором бриллиантового зеленого наносились контуры стандартной обширной раны округлой формы в межлопаточной области. По намеченному контуру рассекалась кожа и поверхностная фасция. На дне раны надсекали мышцы скальпелем. Образовавшийся кожный лоскут стандартного размера переворачивали шерстью вниз к поверхности раневого дефекта с последующим подшиванием к свободному кожному краю и подлежащим тканям по всему периметру непрерывным швом капроновой нитью № 4 (рис. 1). Через 48 часов удаляли лоскут, перед этим предварительно проводили ультразвуковое исследование раны. На УЗИ отмечается отек и утолщение подкожно-жировой клетчатки и повышение её эхогенности, под лоскутом определяется отграниченное жидкостное, анэхогенное образование. После удаления лоскута определяется рана с участками некроза и гнойным отделяемым.

Рис. 1. Модель раны после подшивания кожного лоскута к краям раны и подлежащим тканям.

Рис. 1. Модель раны после подшивания кожного лоскута к краям раны и подлежащим тканям.

Все результаты, полученные после исследования, подвергались статистической обработке с помощью программы IBM SPSS 23.0. Проверку нормальности распределения количественных признаков проводили с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. Для оценки статистической значимости различий при сравнении по количественному признаку - параметрические и непараметрические методы (ANOVA, критерий Краскаля-Уоллеса), в качестве апостериорного критерия выбран критерий Тьюки. Вычисляли М - среднее, s - стандартное отклонение, Ме - медиана, Q1 - верхний квартиль, Q2 - нижний квартиль, n - объем анализируемой группы. Статистически достоверным критическое значение уровня значимости считалось р≤0,05.

Результаты и обсуждение. После удаления кожного лоскута наблюдалась инфицированная рана с классическими признаками воспаления, обильное серозно-гнойное или гнойное отделяемое с участками некрозов в подкожной клетчатке и мышцах (рис. 2). Края и дно раны пастозные, местами покрыты фибрином. Так, подшивание свободного лоскута к краям раны и подлежащим тканям не позволило распространиться инфекции за пределы раны и предотвратило раннее стягивание краев раны. Распространения инфекции за пределы раны в свободное подкожное пространство с образованием флегмон и абсцессов не наблюдалось. Раны у всех животных был одинаковой по форме и площади, что важно для сравнительной оценки воздействия изучаемых препаратов.

Рис. 2. Модель раны после удаления кожного лоскута через 48 часов.

Рис. 2. Модель раны после удаления кожного лоскута через 48 часов.

В ходе исследования получены следующие результаты. При сравнительном анализе планиметрического исследования раны в динамике было выявлено уменьшение площади ран на 3 сутки в контрольной группе до 1958,8±2,1 мм2, а в основной группе до 1941,0 ±3,7 мм2 (р˃0,05), индекс заживления в контрольной группе составил 0,05±0,03% за сутки, в основной - 0,37±0,06% за сутки (р ˃0,05).

Как видно из табл. 1, достоверная эффективность антисептического препарата Повидон-йод отмечается на 7 день. Так площадь раны в контрольной группе к 7 дню уменьшилась до 1664,3±14,8 мм2, а в основной до 1318,3±16,1 мм2 (р˂0,05). Индекс заживления при этом с 3 по 7 день наблюдения в контрольной группе составил 3,7±0,2% за сутки, а в основной - 8,02±0,2% за сутки (р˂0,05). На 15 сутки в контрольной группе площадь раны была 908,5±3,5 мм2, тогда как в основной площадь раны уменьшилась до 367,8±13,6 мм2 (р˂0,05). Индекс заживления в контрольной группе составил 5,6±0,04% за сутки по отношению к предыдущему измерению, а в основной группе - 9,01±0,1% за сутки (р˂0,05). К 20 дню в контрольной группе площадь раны составила 695,0 ±5,2 мм2, а в группе, где применяли Повидон-йод, 185,3±13,8 мм2 (р˂0,05). На 20 день индекс заживления в контрольной группе равен 4,7±0,1%, в основной - 9,9±0,9% за сутки (р˂0,05).

Таблица 1. Изменение площади ран у контрольной и основной групп M±s, мм2

Таблица 1. Изменение площади ран у контрольной и основной групп M±s, мм2

При оценке бактериологического исследования посевов из глубины ран на 3 день наблюдения в контрольной группе были выделены следующие штаммы: St. aureus, Pseudomonas aeruginosae - рост обильный, Proteus mirrabilis - рост ползучий. Кроме указанных штаммов, было выявлено наличие дополнительных штаммов: St. varneri, Enterobacter cloacae, St. epidermidis и E. coli в единичных случаях. К 20 дню были выделены штаммы микробов: St. aureus - рост обильный, Pseudomonas aeruginosae, Proteus mirrabilis - рост умеренный.

В основной группе на 3 день лечения видовой состав микробиоты ран был схожим с контрольной группой. Но, начиная с 7 дня лечения, отмечается значительное снижение обсемененности раневой поверхности. Так, были выделены Pseudomonas aeruginosae, Proteus mirrabilis, St. aureus - рост умеренный. На 15 и 20 дни - St. aureus и Pseudomonas aeruginosae -рост скудный. Другие штаммы не обнаружены.

На 3 сутки наблюдения цитологическая картина в обеих группах была практически идентичной и представлена следующими элементами. Лейкоциты в большом количестве, эпителиальные клетки и эритроциты - единичные, бактерии в виде кокков ++ и кокко-бацилл ++ в поле зрения. Грибков и ключевых клеток не обнаружено. На 7 день наблюдения в контрольной группе цитологическая картина не отличается от 3 дня. В этот период в основной группе при лечении препаратом Повидон йод число лейкоцитов в поле зрения составляло 25-27, эпителиальных клеток 4-5 в поле зрения. К 15 дню цитограмма характеризуется следующим образом: лейкоциты 8-12 в поле зрения, эпителиальные клетки 2-4 в поле зрения. В основной группе на 15 день лечения лейкоциты составили 2-3 в поле зрения, эпителиальные клетки в большом количестве, кокки единичные, такая же картина сохраняется до конца лечения.

В гистологических образцах тканей раны на 3 день наблюдения в обеих группах определяется инфицированное повреждение кожи и подкожной клетчатки с отеком дермы и большим количеством гноевидного содержимого. В подлежащих тканях имеются очаги некроза и гнойного воспаления, представленные лейкоцитами.

На 7 день наблюдения в группе, где применяли раствор Повидон-йода, появляются участки грануляционной ткани с новообразованными сосудами, без признаков эпителизации. Гнойное содержимое уменьшилось (рис. 3).

Рис. 3. Морфологическая картина раны на 7 день лечения Повидон - йодом, увеличение 280: 1 - гнойно-некротический детрит; 2 - молодая грануляционная ткань; 3 - некроз мышечных клеток.

Рис. 3. Морфологическая картина раны на 7 день лечения Повидон - йодом, увеличение 280: 1 - гнойно-некротический детрит; 2 - молодая грануляционная ткань; 3 - некроз мышечных клеток.

На 15 день гистологическая картина представлена созревающей грануляционной тканью, волокно формирующий (рис. 4).

Рис. 4. Морфологическая картина раны на 15 день лечения антисептиком Повидон-йод, увеличение 280: 1 - созревающая грануляционная ткань.

Рис. 4. Морфологическая картина раны на 15 день лечения антисептиком Повидон-йод, увеличение 280: 1 - созревающая грануляционная ткань.

Заключение. Таким образом, проведенное исследования показало, что предложенная модель гнойной раны мягких тканей может быть использована в экспериментальной хирургии в качестве длительно незаживающего дефекта, для проведения сравнительного анализа антибактериальных и биологических свойств нового препарата или комплекса препаратов в лечении гнойных ран.

Список использованных источников:

  1. Измайлов С.Г. Новые технологии в хирургии ран. Изд-во НГМА. - 2004. - С. 340.
  2. Учение о ране: от А.В. Вишневского до наших дней / В.Д. Федоров, A.M Светухин, С.П. Глянцев // Хирургия. - 2004. - С. 56-61.
  3. Морфологические характеристики экспериментальных гнойных ран мягких тканей / А.А. Кабанова, Ф.В. Плотникова, Ю.В. Ходос и др./ - Пермь. - 2015.
  4. Результаты разработки модели инфицированной кожной раны для изучения свойств новых лекарственных препаратов / С.А. Лепехова, Г.Е. Григорьев, Е.В. Коваль и др. - Красноярск: Красноярский государственный аграрный университе". - 2013. - С. 155 .
  5. Пат. № 2321898 Российская Федерация. Способ моделирования инфицированной раны мягких тканей / Ю.Г. Суховей, С.Б. Цирятьева, А.С. Минин и др. - № 2321898; опубл. 10.04.2008 г., Бюл. № 1. - С. 3.
  6. Жданов А.Ю. Экспериментальное обоснование применения ксимедонсодержащих мазевых композиций в лечении гнойных ран: дис. … канд. мед. наук. Нижний Новгород. - 2009.
  7. Савченко Ю.П., Федосов С.Р. Методы определения размеров раневой поверхности. - М.: Эскулапп. - 2013, - С. 102-105 .
  8. Карташев А.В., Воротников А.А. К биографии профессора М.С. Макарова (1906-1977) // История медицины. - 2016. Т. 3 №2 - С. 160 - 161.
  9. Казанцев А.В., Ляпина Е.П. Современные методы диагностики хламидийных инфекций // Бюллетень медицинских интернет-конференций. - 2013. Т 3 №2. - С. 190.