Ежегодно в мире диагностируется более 430 тыс. новых случаев рака мочевого пузыря (РМП), что составляет порядка 3,1% всех злокачественных новообразований и около 40% опухолей мочевыделительной системы. В Российской Федерации ежегодно заболевают больше 16 тысяч человек, за последнее десятилетие отмечается увеличение заболеваемости на 20,3% [1,3,8].
Наиболее распространенной клинической формой заболевания является поверхностная, неинвазирующая в мышечный слой опухоль (рТа, рТ1, CIS), которая рецидивирует в70-90% случаев. От стадии заболевания и степени злокачественности опухоли зависит характер лечения, используются трансуретральная резекция (ТУР), внутрипузырная химио- и/или иммунотерапия, а также проведение комбинированных и сочетанных методов лечения [5,6,9]. В соответствии с рекомендациям RUSSCO для пациентов, подвергавшихся органосохранному лечению, цистоскопия и цитологическое исследование мочи должны выполняться каждые 3 месяца в течение первых 2 лет и далее каждые 6 месяцев, при обнаружении рецидива протокол возобновляется [2].
Болезненность и травматичность процедуры цистокопического исследования часто приводит к нежеланию больных следовать предписанной схеме наблюдения, что увеличивает вероятность неблагоприятного исхода болезни. В связи c этим продолжается поиск новых неинвазивных методов диагностики опухолей мочевого пузыря, пригодных для систематического мониторинга больных. Международная группа экспертов по вопросам маркеров РМП предложила для повышения эффективности диагностики рецидивов использовать одновременно несколько тестов: NMP22, CYFRA 21-1, BTA-stat, UBC, UroVysion [3,4,6,8].
К недостаткам вышеописанных методов можно отнести следующее: тест UBC обладает низкой чувствительностью - около 54%; тест BTA, обладает минусом, связанным с уменьшением информативности при воспалительных заболеваниях мочеполовых путей; тест NMP-22 обладает низкой чувствительностью (50%) к неинвазивным опухолям; для теста CYFRA 21-1 специфичность метода составляет 41%, что обусловливают низкую диагностическую точность метода, тест-система UroVision - дорогой и трудоемкий метод [3,4,6-8].
Повышение числа больных РМП, высокая частотность рецидивов после комбинированного лечения определяют актуальность оптимизации диагностики рецидива заболевания.
Цель работы: идентифицировать предикторы рецидива неинвазивного рака мочевого пузыря на основании исследования клинико-морфологических параметров и показателей клеток осадка мочи.
Материалы и методы. В предлагаемом исследовании было рассмотрено 162 пациента, больных неинвазивным раком мочевого пузыря (Tа, Tis, T1), которые проходили лечение на базе КГБУЗ «Красноярский краевой клинический онкологический диспансер им. А.И. Крыжановского».
Порцию мочи забирали всем пациентам до проведения трансуретральной резекции (ТУР). Полученные образцы мочи центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 мин для осаждения клеточных элементов. После этого супернатант сливали, к осадку добавляли 2 мл забуференного физиологического раствора (PBS), проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжение 1-2 мин и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин. Описанную процедуру отмывки клеточного осадка проводили дважды.
Далее супернатант сливали, к осадку добавляли 0,5 мл PBS, проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжение 1-2 мин. К полученной клеточной взвеси добавляли моноклональные антитела к CD13, меченные фикоэритрином (РЕ – максимум флуоресценции на 578 нм, производитель BD Biosciences, США) в объеме 20 мкл.
Перемешивали на персональном вортексе в течение 20 сек. Добавляли моноклональные антитела к CD15, меченные аллофикоцианином (АРС – максимум флуоресценции на 657,5 нм, производитель BD Biosciences, США) в объеме 20 мкл. Перемешивали на персональном вортексе в течение 20 сек. Далее добавляли моноклональные антитела к CD45, меченные флуоресцеин изотиоционатом (ФИТЦ – максимум флуоресценции на 518 нм, производитель BD Biosciences, США) в объеме 20 мкл. Перемешивали на персональном вортексе в течение 20 сек и убирали в темное место. Инкубацию клеточной взвеси проводили при комнатной температуре на протяжении 15 минут. После инкубации проводили измерение флуоресценции на проточном цитофлуорометре BD FACS Canto II (Becton Dickinson, США).
Для изучения соотношения в осадке мочи клеточных элементов, находящихся в различных фазах клеточного цикла, брали пробирку №2, полученную после выделения и отмывки, описанных выше. Изучение клеточного цикла осуществляли с использованием метода флуоресцентного окрашивания ki-67 и йодидом пропидия. К выделенным клеточным элементам из осадка мочи добавляли 3 мл 96% этилового спирта. После этого клеточную взвесь инкубировали на холоде в течении 30 минут, затем дважды отмывали в PBS. В дальнейшем проводили окрашивание моноклональными антителами к ki-67 меченными флуоресцеин изотиоционатом (ФИТЦ - максимум поглощения на 492 нм, максимум флуоресценции на 518 нм, производитель BD Biosciences, США) в объеме 20 мкл. Также добавляли йодид пропидия (фенантридин-3,8-диамино-5-[3-(диэтилметиламмоний) пропил]-6-фенил-дийодид) в концентрации 2 мг/мл (максимум поглощения на 488 нм, максимум флуоресценции на 610 нм, Sigma-Aldrich, США) в объеме 20 мкл, после чего взвесь перемешивали и инкубировали в темноте 15 минут.
После проведения ТУР всем пациентам проводилась внутрипузырная химиотерапия митомицином 40 мг внутрипузырно, 1 раз в неделю, 6-8 недель. Наблюдение за пациентами после окончания комбинированного лечения осуществлялось в течение трех лет. На основании результатов динамического наблюдения больные РМП были разделены на 2 группы: 1 группа – без рецидива заболевания (n=113); 2 группа - с рецидивом (n=49).
Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью пакета прикладных программ «Statistica 7.0» (StatSoft, Inc., США).
Результаты и обсуждения. Для определения переменных, позволяющих прогнозировать развитие рецидива НРМП, был применен метод дискриминантного анализа. В качестве предикторов оценивались клинико-морфологические показатели: наличие гематурии, степень дифференцировки, наличие метаплазии, количество опухолей и их размер, показатели общего и биохимического анализов крови, а также экспрессия поверхностных антигенов CD13, CD15, CD45 и данные митотического цикла G1-фаза, S-фаза, G2-фаза, митоз, G0-фаза клеточного осадка мочи.
В анализ были включены 162 единицы наблюдения (113 (69,7%) пациентов, у которых после комбинированного лечения в период 3-хлетнего наблюдения отсутствовал рецидив и 49 (31,3%) – у которых развился рецидив заболевания).
При проведении процедуры дискриминантного анализа изучаемые признаки рассматривались как классификационные на основании корреляции с канонической дискриминантной функцией (табл. 1). Вклад каждого признака в результат классификации показывает абсолютное значение нормированного коэффициента дискриминантной функции.
Структурная матрица, представленная в таблице 1, отражает меру корреляции дискриминантных переменных с канонической дискриминантной функцией.
Таблица 1. Нормированные коэффициенты канонических дискриминантных функций
Из таблицы 1 видно, что наибольший вклад результат классификации вносят показатели G0-фаза клеточного цикла и экспрессия CD15. Наибольшую корреляцию с канонической дискриминантной функцией имеют S-фаза и G0-фаза.
Каноническая корреляция, описывающая меру связи между дискриминирующей функцией и группами наблюдений, составляет 0,328, что объясняет 32,8% дисперсии исходных переменных. Лямбда Уилкса при оценке канонической дискриминантной функции является статистически значимой и составляет 0,893 (χ2=17,681; р=0,023).
При этом имеет место статистически значимые отличия матриц ковариаций (дисперсий) в группах наблюдения по критерию М Бокса (р<0,001).
Коэффициенты линейных моделей дискриминантной функции, включающих в себя классификационные признаки, которые характеризуют принадлежность обследованных пациентов к группе с наличием или отсутствием рецидива, представлены в табл. 2.
Таблица 2. Линейные модели дискриминантной функции развития рецидива
Исходя из табл. 2, линейная дискриминантная функция для отсутствия рецидива выглядит следующим образом:
D1=-85,254+0,997x1+0,221x2-0,229x3+1,806x4+1,830x5+0,458x6+2,020x7+0,528x8.
Линейная дискриминантная функция, моделирующая развитие рецидива после комбинированного лечения НРМП:
D2=-87,626+0,917x1+0,294x2-0,269x3+1,724x4+1,882x5+0,480x6+1,908x7+0,552x8,
где
D1 и D2– линейные дискриминантные функции,
х1– экспрессия CD13,
х2– экспрессия CD14,
х3– экспрессия CD45,
х4– количество клеток в G1 фазу клеточного цикла,
х5 – количество клеток в S фазу клеточного цикла,
х6 – количество клеток в G2 фазу клеточного цикла,
х7 – количество клеток, находящихся в митозе,
х8 – количество клеток в G0 фазу клеточного цикла.
При D1>D2 –низкий риск рецидива НРМП, при D1<D2 – высокий риск.
На основании полученных дискриминантных функций была произведена итоговая классификация наблюдений, результаты которой представлены в табл. 3.
Таблица 3. Классификация при помощи дискриминантных функций
На основании применения данной модели была построена ROC-кривая (рис. 1). По результатам построения ROC-кривой показатель AUC составил 0,711±0,047 (ДИ 95% 0,619-0,804; р<0,001), что указывает на удовлетворительное качество прогностической модели.
Рис. 1. ROC-кривая прогнозирования развития рецидива.
Таким образом, получена статистически значимая дискриминантная модель, позволяющая при помощи дискриминантных функции провести классификацию единиц наблюдения по факту наличия или отсутствия рецидива с чувствительностью - 71,4%, специфичностью - 65,5%. Общая точность модели составила 67,3%.
Для повышения точности модели в качестве классификационных признаков были использованы клинические и анатомо-морфологические факторы течения заболевания. Методом шагового отбора были отобраны 4 предиктора развития рецидива НРМП. Структурная матрица корреляции дискриминантных переменных с канонической дискриминантной функцией, на основании которой были отобраны переменные, представлена в табл. 4.
Таблица 4. Нормированные коэффициенты канонических дискриминантных функций
Наибольший вклад в результаты классификации из отобранных переменных вносят количество опухолей и наличие гематурии. Эти же признаки имеют наибольшую корреляцию с канонической дискриминантной функцией.
Каноническая корреляция составила 0,534, что объясняет 53,4% дисперсии исходной бинарной переменной. Лямбда Уилкса при оценке канонической дискриминантной функции составила 0,715 (χ2=52,994; р<0,001). Коэффициенты линейных функций дискриминантной модели, представлены в табл. 5.
Таблица 5. Линейные модели дискриминантной функции развития рецидива
Исходя из табл. 5, линейная дискриминантная функция для развития рецидива после комбинированного лечения НРМП представлена следующим уравнением:
D1=-49,810+1,322x1+0,251x2+1,665x3+3,764x4
Линейная дискриминантная функция, моделирующая развитие послеоперационных осложнений:
D2=-53,945+1,380x1+0,185x2+2,486x3+1,962x4,
где D1 и D2– линейные дискриминантные функции;
х1– количество клеток в S фазу клеточного цикла,
х2– количество клеток в G0 фазу клеточного цикла,
х3– количество опухолей,
х4– гематурия (0 – отсутствие, 1 - наличие).
При D1>D2 –низкий риск развития рецидива НРМП, при D1<D2 – высокий риск.
Итоговая классификация наблюдений на основании полученных дискриминантных функций представлена в табл. 6.
Таблица 6. Классификация результатов прогнозирования развития рецидива неинвазивного рака мочевого пузыря
Добавление к фенотипическим характеристикам клеток осадка мочи клинических и анатомо-морфологических показателей улучшает параметры статистически значимой дискриминантной модели. Чувствительность данной модели составила 79,6%, специфичность - 72,6%. Общая точность модели увеличивается до 74,6%.
Данные ROC-анализа также показывают улучшение прогностических качеств модели (рис. 2). По результатам построения ROC-кривой показатель AUC составил 0,767±0,041 (ДИ 95% 0,680-0,842; р<0,001), что указывает в целом на удовлетворительное качество прогностической модели.
Рис. 2. ROC-кривая прогнозирования развития рецидива.
Таким образом, в результате проведенной работы с применением методов математического процессинга разработана математическая модель прогнозирования развития рецидива неинвазивного рака мочевого пузыря с высокой диагностической точностью 74,6%, использующей в качестве переменных клинические показатели (гематурия и количество опухолей), а также количество клеток в синтетическую (S) и пресинтетическую (G0) фазу клеточного цикла.