Русский English

Ильяди Е.Б.

Полиморфизм гена Р21 при генитальном эндометриозе

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

Эндометриоз является хроническим, прогрессирующим и рецидивирующим заболеванием, поражающим 12-60% женщин репродуктивного возраста, которое характеризуется эктопическим разрастанием эндометрия [1-3]. Эндометриоз является одной из самых распространенных причин болевого синдрома, проявляется дисменореей, диспареунией и приводит к бесплодию. Частота бесплодия при всех локализациях генитального эндометриоза примерно в 3-4 раза превышает частоту бесплодия в популяции [3,4]. При эндометриозе нарушение функции клеток эндометрия связано с экспрессией дефектных (мутантных) генов. Наблюдаемые семейные случаи заболевания указывают на возможность участия в патогенезе заболевания генетических дефектов [11], формируется неблагоприятный «генетический фон», который под влиянием дополнительных факторов реализуется в патологический фенотип [8].

Современные исследователи склонны расценивать автономный рост очагов эндометриоза как результат отсутствия адекватного контроля за пролиферацией и дифференцировкой клеток гетеротопий со стороны организма женщины. Клеточная пролиферация контролируется сетью генов, немаловажную роль среди которых играет ген р21. Белковый продукт гена p21 – один из мощных ингибиторов циклинзависимых киназ, блокирующий киназную активность, необходимую для перехода клетки из пресинтетической фазы G1 в синтетическую S-фазу, и специфически активируемый белком p53. При отсутствии гена p53 или в случае, когда происходит его мутация, нарушается активация гена р21, и его протеиновый продукт Waf1 не синтезируется. При повреждении дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) активированный белок р53 взаимодействует с промоторной областью гена р21, увеличивая тем самым синтез продукта Waf1. Белковый продукт гена р21 связывается с циклинзависимыми киназами, блокируя их и препятствуя тем самым синтезу рибонуклеиновой кислоты (РНК) [6].

Наличие полиморфных вариантов генов-регуляторов клеточного цикла, в частности гена р21, делает возможным изменение уровня контроля над остановкой клеточного цикла и не обеспечивает полноценной реализации исправления генетического аппарата клетки. В связи с этим целью настоящего исследования явился анализ распределения аллелей и генотипов полиморфных вариантов гена р21 у женщин с генитальным эндометриозом.

Материал и методы исследования. В программу исследования вошло 300 женщин репродуктивного возраста, находившихся на стационарном лечении в гинекологической клинике ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России. Основную группу составили 200 женщин с наружным генитальным эндометриозом. В группу контроля включено 100 женщин, которым проводилась диагностическая лапароскопия по поводу синдрома хронической тазовой боли, бесплодия и у которых не было выявлено органической патологии, а также женщины, реализовавшие свои репродуктивные планы, которым проводилась добровольная хирургическая стерилизация. Всем женщинам была проведена лапароскопия по стандартной методике с использованием аппаратуры фирмы «KarlStorz» (Германия) и последующим гистологическим исследованием операционного материала. У всех женщин было получено добровольное информированное согласие на забор венозной крови и использование её для проведения исследований. Кровь для исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях у всех пациенток утром в день операции. Выделение ДНК из периферической крови проводили согласно инструкции, прилагаемой к набору «ДНК-сорб-В» («ИнтерЛабСервис», Россия). Изучение распределения генных полиморфизмов образцов ДНК гена p21 (1026 A/G, rs2395655; 369 G/C, rs4135239) осуществляли с помощью метода ПЦР в режиме реального времени, используя олигонуклеотидные праймеры к специфическому участку гена (р21 G1026A: forward 5’-CAT-TTC-TTT-GCT-GCA-TGA-TCT-GAG-TT-3’ и reverse 5’-CCC-TAC-ACT-CAC-CTG-AAC-AGA-AGG-3’;р21 А369С: forward 5’- GAT-TTG-TGG-CTC-ACT-TCG-TGG-GG-3’ и reverse 5’-GCT-CCT-GGC-TGC-CCA-GCG-T-3’ и зонды к участку внутри амплифицируемого фрагмента ДНК (5’-FAM-CAA-CCA-CAG-GGG-TTT-3’ и 5’-ROX-CAG-GGA-TTT-CTT-CTG-T-3’;5’-FAM-CAT-GTG-CAG-GGA-AG-3’ и 5’-ROX-GTG-CGG-ACA-TGT-GCA-CGG-A-3’ соответственно) [10].

Амплификацию осуществляли согласно инструкции, прилагаемой к набору «АмплиСенс-200-1» («ИнтерЛабСервис», Россия). Программа амплификации включала 5 минут предварительной денатурации при 94С° и 30 циклов: 94 С° – 30 с, 64 С° – 30 с, 72 С° – 40 с. Кривые накопления флуоресцентного сигнала анализировались с помощью программного обеспечения прибора ДТ-96 («ДНК-Технология», Россия). Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью точного теста Фишера. Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с эндометриозом сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах больных и здоровых индивидов, используя критерий χ2 с поправкой Йетса на непрерывность. При численностях генотипов менее пяти использовали точный тест Фишера.

Результаты исследования и их обсуждение. На первом этапе исследования нами был проведен анализ распределения полиморфного вариантаG1026Aгена р21 у женщин с эндометриозом, который выявил, что частота встречаемости АА-генотипа (16,00%) превышала таковую у здоровых лиц (6,00%) более чем в два раза (р=0,03). Частота встречаемости «патологического» аллеля А гена р21 G1026A у женщин с эндометриозом также более чем в полтора раза превышала аналогичный показатель у женщин без данной патологии (32,00 и 21,00% соответственно) (р=0,005) (табл.1). Риск развития эндометриоза при носительстве минорного аллеля А гена р21(G1026A) возрастает в 1,7 раза, а при наличии АА-генотипа – почти в 3 раза. На втором этапе было проведено генотипирование обследованных женщин на предмет определения частоты встречаемости полиморфного варианта G369C гена р21. При этом было показано, что частота встречаемости минорного аллеля А гена р21(G369C) у женщин с эндометриозом статистически значимо (р=0,02) превышала таковую у здоровых лиц (23,00 и 15,00 % соответственно). Частота встречаемости «редкого» генотипа CC у женщин с эндометриозом оказалась в 5,5 раз выше, чем у женщин без эндометриоза (11,00 и 2,00% соответственно) (табл. 2). Было показано, что риск развития эндометриоза при носительстве C-аллеля возрастает в 1,7 раза, CC-генотипа – почти в 3 раза.

Таким образом, проведенное нами исследование свидетельствует о том, что генитальный эндометриоз характеризуется увеличением частоты «редких» аллелей и генотипов: А и АА полиморфизма G1026A гена р21,С и СС полиморфизма G369C гена р21 соответственно. Кроме того с перечисленными выше полиморфными вариантами гена р21 связан и повышенный риск развития генитального эндометриоза. В настоящее время в литературе в основном представлены данные о влиянии полиморфных вариантов гена р21 на развитие и течение онкологических заболеваний [5, 8, 9]. Кроме того в исследовании австрийских ученых, посвященному поиску функциональных генетических полиморфизмов при заболеваниях женской репродуктивной системы, не было выявлено статистической ассоциации между полиморфным вариантом гена р21 и генитальным эндометриозом [7].

Таблица 1. Распределение вариантных генотипов гена р21 G1026A (в абс. знач. и в %) у женщин с эндометриозом.

Таблица 1. Распределение вариантных генотипов гена р21 G1026A (в абс. знач. и в %) у женщин с эндометриозом

Примечание: здесь и далее р1 – уровень статистической значимости различий частоты генотипов между группами женщин с эндометриозоми и без эндометриоза, р2 – уровень статистической значимости различий частоты аллелей между группами женщин с эндометриозом и без эндометриоза, χ2 – стандартный критерий Пирсона для сравнения частоты генотипов и аллелей генов.

Таблица 2. Распределение генотипов и аллелей гена р21 G369C (в абс. знач. и в %) у женщин с эндометриозом.

Таблица 2. Распределение генотипов и аллелей гена р21 G369C (в абс. знач. и в %) у женщин с эндометриозом

Увеличение частоты встречаемости минорных генотипов и аллелей гена р21, обнаруженное в настоящем исследовании, у женщин с эндометриозом может свидетельствовать о значимости привносимых изменений «патологических» генотипов в конформационную или функциональную характеристику кодируемого белкового продукта, обеспечивающего индивидуальные особенности во взаимодействии компонентов – участников регуляции клеточного цикла. Минорные варианты гена р21 оказывают значимое влияние на развитие эндометриоза, уменьшая контроль над прохождением клеточного цикла и не осуществляя элиминации измененных клеток путем апоптотической гибели, которая в норме осуществляется через р53-опосредованное увеличение экспрессии р21 и активацию каспаз [9, 11].

Таким образом, дальнейшее изучение и выявление ассоциации полиморфных вариантов генов регуляторов клеточного цикла с риском возникновения и рецидивирования генитального эндометриоза является актуальной и перспективной задачей. Идентификация генов и их аллелей, от экспрессии которых зависит предрасположенность или резистентность к эндометриозу позволила бы глубже проникнуть в фундаментальные механизмы данной патологии. В результате появилась бы возможность использовать методы генетического типирования для прогнозирования характера течения эндометриоза, а также выявления среди здоровых женщин групп с генетически повышенным риском заболевания, требующих первоочередных мер профилактики и динамического наблюдения.


Список использованных источников:

1. Адамян Л.В., Спицын В.А., Андреева Е.Н. Генетические аспекты гинекологических заболеваний. – М.: ГЭОТАР–Медиа. 2008. – 192 с.

2. Айламазян Э.К. Акушерство. - Н.Новгород: НГМА, 1997. – 282с.

3. Баскаков В.П. Эндометриоидная болезнь. - СПБ.: Издательство Н-Л, 2002. - 452с.

4. Ищенко А.И., Кудрина Е.А. Эндометриоз: диагностика и лечение. – М.: МИА. 2008. – 176 с.

5. Associations between common polymorphisms in TP53 and p21WAF1/Cip1 and phenotypic features of breast cancer/ B.L. Powell, I.L. van Staveren, P. Roosken et al.// Carcinogenesis. – 2002. – Vol. 23. – P. 311-315.

6. Li R., Waga S., Hannon G.J., Beach D., Stillman B. Differential effects by the p21 CDK inhibitor on PCNA-dependent DNA replication and repair// Nature. 1994. Vol. 6. - P. 534-537.

7. Hsieh Y.Y., Tsai F.J., Chang C.C. et al. P21 gene codon 31 arginine/serine polymorphism: non-association with endometriosis// J Clin Lab Anal. 2001. Vol. 15, № 4. – P. 184-187.

8. Xiong Y., Hannon G.J., Zhang H. et al. P21 is a universal inhibitor of cyclin kinases// Nature. – 1993. – Vol. 16. – P. 701-704.

9. P53 dephosphorylation and p21Cip1/Waf1 translocation correlate with caspase-3 activation in TGF-β1-induced apoptosis of HuH-7 cells/ G. Fan, X. Ma, P.Y. Wong et al.// Apoptosis. – 2004. – Vol. 9, № 2. – Р.211-221.

10. The ATDC (TRIM29) protein binds p53 and antagonizes p53-mediated functions/ Z. Yuan, A. Villagra, L. Peng et al.// Molecular and Cellular Biology. – 2010. – Vol. 30, №. 12. – Р. 3004-3015.

11. Zhang Z., Wang Z., Liu X. et al. Up-regulation of p21WAF1/CIP1 by small activating RNA inhibits the in vitro and in vivo growth of pancreatic cancer cells// Tumori. – 2012. – Vol. 98, № 6. - Р. 804-811.


02.04.2013 14:53:00