Русский English

Терешин А.Т., Болатчиев А.Х., Логвина Л.Л., Бучко Л.А.

Функциональная активность коры надпочечников у больных с синдромом поликистозных яичников

Пятигорский научно-исследовательский институт курортологии

Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) может быть обусловлен нарушениями как в центральных, так и периферических звеньях репродуктивной системы [1-4,6]. Специфическим признаком СПКЯ является гиперандрогения, которая может быть яичникового или надпочечникового генеза [1,2,4]. Надпочечниковая гиперандрогения обычно рассматривается как проявление дефицита ферментативных систем стероидогенеза не только врожденного, но и приобретенного характера [1,2,4,5,10]. При исследовании больных с надпочечниковой гиперандрогенией было установлено, что развитие СПКЯ возможно при отсутствии недостаточности ферментных систем синтеза стероидов, в частности, 21-гидроксилазы (21-ОН) [4,6,7,11].

Выявление источника гиперандрогении представляет значительные трудности [4,10]. Так, функциональная проба с использованием АКТГ позволяет выявить женщин-носительниц стертых дефектов ферментных систем коры надпочечников [1,2,4]. Несмотря на филогенетическую общность яичников и коры надпочечников, аналогичным спектром синтезируемых андрогенов и сходством клинической картины при гиперандрогениях различного генеза [4,10], данные о функциональной активности коры надпочечников у больных СПКЯ носят крайне противоречивый и отрывочный характер.

Цель настоящего исследования – изучение функциональной активности коры надпочечников у больных СПКЯ в условиях стимуляции АКТГ.

Материалы и методы. В связи с этим обследовано 60 больных СПКЯ в возрасте от 22 до 37 лет (средний возраст – 27,9±1,4 года) с длительностью бесплодия от 1 года до 12 лет (в среднем 6,3±1,4 года). Диагноз СПКЯ верифицирован при гистологическом исследовании биоптатов яичников, взятых при лапароскопии. Пациентки не проводили гормонотерапию на протяжении 3 мес до проведения исследования.

Всем больным проводили тесты функциональной диагностики (ТФД), определение концентрации ФСГ, ЛГ, кортизола (К), 17-оксипрогестерона (17-ОП), тестостерона (Т), дегидроэпиандростерон-сульфата (ДГЭА-С) в крови на 5-7-й день цикла или менструальноподобной реакции хемолюминесцентным методом с помощью системы «Анерлайт» с использованием тест-системы «Immunotech» (Чехия).

Функцию коры надпочечников оценивали с помощью гормональной пробы с АКТГ 36-часового действия. В 8 ч производили взятие крови из локтевой вены, затем подкожно в плечо вводился препарат синактен-депо («Сиба-Гейги», Швейцария) в количестве 1 мг/мл. Следующее взятие крови осуществлялось в 17 ч (на пике действия препарата) и в 8 ч следующего дня. Полученные данные обрабатывались с помощью дискриминантной функции (Д) по формуле, разработанной И.Т. Дзенис [1]: Д=0,052 [x1]+0,05 [x2]-0,018 [x3], где х1 – уровень 17-ОП через 9 ч после введения АКТГ; х2 – отношение базального уровня К к базальному уровню 17-ОП; х3 – отношение уровня К через 9 ч после введения АКТГ к соответствующему уровню 17-ОП. Взятие крови через 24 ч после введения АКТГ производилось для оценки функции коры надпочечников на фоне снижения активности препарата. При Д>0,069 пациентка считалась носительницей гена недостаточности (21-ОН) [1]. Клиническая точность метода 85%. В качестве косвенной оценки активности фермента 21-ОН судили по отношению ΔК/Δ17-ОП [11]. Контрольную группу составили 20 здоровых женщин репродуктивного возраста с регулярным овуляторным менструальным циклом.

Полученные результаты обработаны статистическим непараметрическим методом Уайт в малых выборках и методом Стьюдента.

Результаты исследований. Олигоменорея была у 36 (60%), аменорея – у 9 (15%), дисфункциональные маточные кровотечения – у 7 (11,7%), регулярный менструальный цикл – у 8 (13,3%) больных. Первичное бесплодие было у 48 (80%), вторичное – у 12 (20%). По ТФД у 52 (86,7%) больных была ановуляция, у 8 (13,3%) – НЛФ.

Согласно полученным показателям Д, больные были разделены на 2 группы: 1-я группа – 17 (28,3%) женщин, являющиеся гетерозиготными носительницами гена недостаточности 21-ОН (Д>0,069), и 2-я группа – 43 (71,7%) женщины, не являющиеся носительницами (Д<0,069). Сравнительный анализ клинико-лабораторных характеристик носителей и неносителей мутантного аллеля гена 21-ОН приведен в табл. 1.

Таблица 1. Сравнительная характеристика пациенток-носителей (1-я группа) и неносителей (2-я группа) мутантного аллеля гена 21-ОН

Таблица 1. Сравнительная характеристика пациенток-носителей (1-я группа) и неносителей (2-я группа) мутантного аллеля гена 21-ОН

Примечание: * - р<0,05

Представленные в табл. 1 данные свидетельствуют об однородности сравниваемых 2-х групп по возрасту, менархе, длительности заболевания и бесплодия, выраженности гирсутизма. Вместе с тем характер нарушений менструальной и репродуктивной функции у исследуемых пациенток различался, причем у женщин-носителей отмечена значительно меньшая частота выраженных, тяжелых нарушений. Так, у больных 1-й группы нарушения менструального цикла с менархе по типу олигоменореи имели место в 41,2%, во 2-й группе – в 67,4% случаев. У 29,4% больных 1-й группы был регулярный ритм менструаций с менархе, а у пациенток 2-й группы – лишь у 6,9%. Однако, вторичная аменорея встречалась в 2 раза чаще (23,5%) в 1-й группе по сравнению со 2-й (11,7%), ДМК были в 2,4 раза больше (13,9%) во 2-й группе по сравнению с 1-й (5,9%).

У женщин 2-й группы установлен более высокий процент (86,1%) первичного бесплодия по сравнению с больными 1-й группы (64,7%). У 6 (29,4%) больных 1-й группы были спонтанные беременности, в 2 (11,8%) случаях окончившиеся родами, в 1 (5,9%) – абортом, в 3 (17,6%) - самопроизвольными выкидышами в сроки 10-12 недель беременности. Во 2-й группе спонтанные беременности были у 6 (13,9%) больных, в 2 (4,7%) случаях окончившиеся родами, в 1 (2,3%) – абортом, в 3 (6,9%) – самопроизвольными выкидышами в сроки 10-12 недель беременности.

Нарушение в генеалогическом анамнезе репродуктивной системы у родственников I-III степени были в 1,4 раза больше в 1-й группе (70,6%) по сравнению со 2-й (51,2%); причем ранняя смертность рожденных детей отмечена в 17,6% случаев у родственников I-III степени родства.

Концентрация Т в крови и коэффициент ЛГ/ФСГ были достоверно выше (р<0,05) во 2-й группе по сравнению с 1-й. Яичниково-маточный индекс был достоверно больше (р<0,05) во 2-й группе по сравнению с 1-й.

По-видимому, причиной нарушения менструальной функции у больных 1-й группы является стресс, который приобретает хронический характер [8,10]. Влияние стресса, как провоцирующего фактора отмечали 12 пациенток; у 3 – менструальный цикл нарушился после неблагоприятного исхода беременности; у 2 – после резкого снижения веса, у 4 – после развода с мужем, у 2 – в связи с тяжелыми материально-бытовыми условиями. 5 пациенток 1-й группы, сохранившие регулярный ритм менструаций, отмечали неустойчивость менструального цикла, его сезонные колебания, нарушения цикличности после эмоционального, умственного или физического напряжения, инфекционных заболеваний. Таким образом, стресс и другие неблагоприятные факторы создают условия, при которых надпочечники носителей мутации гена недостаточности 21-ОН функционируют с повышенной активностью, что приводит к проявлению недостаточности 21-ОН и гиперандрогении. Второй отличительной особенностью репродуктивной функции носителей мутаций 21-ОН является невынашивание беременности. Этот факт объясняется тем, что беременность относится к состояниям, активизирующим функцию коры надпочечников.

Подводя итог сравнительному анализу параметров репродуктивной системы пациенток 2-х групп, следует отметить, что длительное течение заболевания и бесплодия, а также предшествующее лечение, проведенное большей части женщин 1-й и 2-й групп затрудняло выявление специфических клинико-лабораторных признаков, характеризующих носителей мутантного аллеля гена 21-ОН. Этим объясняется отсутствие достоверных различий между клинико-лабораторными параметрами 2-х групп больных. Лишь применение нагрузочной пробы с АКТГ дало возможность выявить недостаточность ферментной активности 21-ОН у 28,3% больных СПКЯ.

Влияние снижения активности 21-ОН на стероидогенез в коре надпочечников у носителей и неносителей мутаций 21-ОН отражено в табл. 2.

Таблица 2. Содержание 17-оксипрогестерона, кортизола и дегидроэпиандростерон-сульфата в крови у носителей и неносителей мутаций 21-гидроксилазы больных синдромом поликистозных яичников после введения синактена

Таблица 2. Содержание 17-оксипрогестерона, кортизола и дегидроэпиандростерон-сульфата в крови у носителей и неносителей мутаций 21-гидроксилазы больных синдромом поликистозных яичников после введения синактена

Из табл. 2 следует, что через 9 ч. после пробы с АКТГ концентрация 17-ОП у носителей мутаций 21-ОН повышается в 4,8 раза, а через 24 ч. снижается в 1,3 раза по сравнению с пробой с АКТГ, проведенной через 9 ч.

У неносителей 21-ОН концентрация 17-ОП в крови через 9 ч после пробы с АКТГ повышается в 3,2 раза и через 24 ч снижается в 2,8 раза по сравнению с пробой АКТГ, проведенной через 9 ч. Концентрация в крови 17-ОП через 24 ч после введения АКТГ у носителей мутаций 21-ОН была в 3,3 раза выше по сравнению с концентрацией 17-ОП в крови у неносителей 21-ОН.

Концентрация К в крови у носителей мутаций 21-ОН через 9 ч. после пробы с АКТГ повысилась в 4,6 раза и через 24 ч снизилась в 1,5 раза по сравнению с пробой, проведенной через 9 ч после введения АКТГ.

У неносителей мутаций 21-ОН концентрация К в крови через 9 ч после пробы с АКТГ повысилась в 4,6 раза и через 24 ч снизилась в 1,5 раза по сравнению с пробой, проведенной через 9 ч после введения АКТГ.

Цифровые значения К в крови через 24 ч после введения АКТГ в группе носителей и неносителей мутаций 21-ОН находились на одинаковом уровне (р>0,05). Относительно низкий уровень К и достоверно более высокий уровень 17-ОП на пике стимуляции АКТГ у женщин-носительниц мутантного аллеля 21-ОН являются отражением ферментного блока в стероидогенезе коры надпочечников. У пациенток с СПКЯ обнаружено замедленное восстановление исходной концентрации К после введения АКТГ по сравнению с контрольной группой.

Уровень ДГЭА-С через 24 ч после введения АКТГ превышал исходную величину и уровень через 9 ч во всех группах. Уровень ДГЭА-С у пациенток, не являющихся носительницами, увеличился в 1,8 раза через 9 ч и в 2,3 раза через 24 ч после введения АКТГ. Уровень ДГЭА-С в контрольной группе увеличился в 1,9 раза через 9 ч и 2,2 раза через 24 ч после введения АКТГ. Обращает на себя внимание достоверно более высокое повышение ДГЭА-С после введения АКТГ в группе женщин-носительниц по сравнению с женщинами-неносительницами и контрольной группы: при этом уровень ДГЭА-С увеличился в 2,8 раза через 9 ч и 3,8 раза через 24 ч после введения АКТГ.

Повышение концентрации в крови ДГЭА-С при стимуляции надпочечников кортикотропином, может указывать на недостаточность 3β-ол-дегидрогеназы [4]. Однако, возможность подобного нарушения исключается, поскольку повышение синтеза ДГЭА-С сопровождалось увеличением продукции К. Полученные данные позволяют считать, что избыточная продукция ДГЭА-С у больных данной группы является следствием функциональной гиперактивности всей коры подпочечников, по крайней мере, пучковой и сетчатой зоны, и повышенной реактивности на воздействие стимулирующих факторов экзогенного и эндогенного характера. Такое повышение чувствительности коры надпочечников реализуется на уровне клеточного рецепторного аппарата и связано с повышенной реактивностью системы гипоталамус-гипофиз-кора надпочечников [4]. По видимому, подобный механизм может определять развитие СПКЯ у части больных при воздействии стрессорных факторов. Поэтому повышенный базальный уровень ДГЭА-С в крови не является достаточно надежным критерием в дифференциальной диагностике надпочечникового и яичникового источника гиперандрогении.

Относительная активность 21-ОН в группе женщин, являющихся носительницами мутантного гена недостаточности 21-ОН, (95,78±13,51) в 2 раза ниже по сравнению с контрольной группой (196,19±12,32, р<0,05), а в группе женщин, неносительниц дефектного гена, активность 21-ОН (138,56±12,37) в 1,4 раза ниже по сравнению с контрольной группой (р<0,05). При индивидуальном анализе значений Д было обнаружено, что они различаются между собой, колеблясь от 0,1 до 3,9, в связи с чем мы выделили 3 подгруппы среди Д-положительных больных: А – женщины с «Д» = 0,1 – 0,49 (5 человек); Б – женщины с Д = 0,5 – 0,99 (6 человек); В – женщины с Д >1,0 (6 человек).

На рис. 1 представлены результаты проб с АКТГ у 3-х подгрупп носителей мутаций 21-ОН.

У больных с низкими показателями «Д» концентрация 17-ОП в крови через 9 ч после стимуляции АКТГ повысилась в 3,5, со средними показателями «Д» - в 4,6, с высокими показателями «Д» - в 5,9 раза по сравнению с исходными данными (3,78±0,17 нмоль/л). Таким образом, на фоне стимуляции надпочечников АКТГ было обнаружено различие между подгруппами, которое заключалось в достоверном увеличении (р<0,05) концентраций 17-ОП по мере возрастания показателя «Д», т.е. минимальным значением «Д» соответствовало и незначительное снижение активности фермента 21-ОН, что имело высокий коррелятивный характер (r=0,87, р<0,05).

Рис. 1 Влияние пробы с АКТГ на концентрацию 17-оксипрогестерона и кортизола у больных носителей мутантного гена аллеля 21-гидроксилазы с различными значениями «Д»

Рис. 1 Влияние пробы с АКТГ на концентрацию 17-оксипрогестерона и кортизола у больных носителей мутантного гена аллеля 21-гидроксилазы с различными значениями «Д»

У больных с низкими показателями «Д» концентрация К в крови через 9 ч после стимуляции АКТГ повысилась в 4,6, со средними показателями «Д» - в 4,5, с высокими показателями «Д» - в 4,2 раза по сравнению с исходными данными (389,51±22,36 нмоль/л), т.е. пациентки с низкими показателями «Д» имели тенденцию к повышению концентрации К в крови после стимуляции АКТГ по сравнению с пациентками, имеющими более высокие показатели «Д». Влияние различных степеней снижения фермента 21-ОН на репродуктивную систему у больных СПКЯ представлено в табл. 3.

Из табл. 3 следует, что у женщин с выраженным снижением активности 21-ОН отмечалось запаздывание менархе на один год по сравнению с популяционной группой. У 50% этих больных менархе было после 15 лет. У 66,7% больных с менархе отмечались нарушения менструального цикла по типу олигоменореи, у 2 больных после нескольких редких менструаций наступила аменорея. Для этой группы больных характерно первичное бесплодие. В подгруппе с незначительным дефицитом 21-ОН позднее менархе имело место лишь в 20% случаев, нарушение менструального цикла с менархе – в 20%. Средний возраст менархе не отличался от популяционной группы. 80% пациенток этой подгруппы имели регулярный менстуральный цикл с начала менархе.

Таблица 3. Характеристика репродуктивной системы больных с синдромом поликистозных яичников с различной степенью снижения активности 21-гидроксилазы

Таблица 3. Характеристика репродуктивной системы больных с синдромом поликистозных яичников с различной степенью снижения активности 21-гидроксилазы

Спонтанные беременности в 1-й подгруппе наступали в 60%, невынашивание беременности – в 20%, роды – в 40%, во 2-й подгруппе – в 33,3%, 33,3% случаев соответственно, т.е. во 2-й подгруппе со средним снижением ферментативной активности 21-ОН спонтанные беременности окончились самопроизвольными выкидышами. Таким образом, по мере нарастания энзимной недостаточности 21-ОН нарушения в репродуктивной системе наступали раньше и носили более выраженный клинический характер.

Как показал анализ, число осложнений течения беременности и родов, а также самопроизвольных прерываний беременности у этих больных не было связано с возрастом. Следовательно, можно предположить: либо женщина в период беременности особенно чувствительна к влиянию неблагоприятных факторов среды, либо сама беременность может являться тем фактором, который вызывает функциональные изменения надпочечников. Было показано, что у женщин на фоне нормально протекающей беременности выявляется гиперплазия коры надпочечников: суммарный уровень К в крови возрастает, хотя уровень свободного К не увеличивается за счет того, что 90% его находится в связанном состоянии [3]. По-видимому, этот механизм позволяет регулировать уровень К в крови беременной, несмотря на сдвиги в состоянии надпочечников, обусловленные беременностью.

Вследствие нарушения стероидогенеза у гетерозиготных носительниц недостаточности 21-ОН, выявляется его недостаточность только в условиях повышенной функции надпочечников. В период беременности выделяется значительно больше андрогенов и минералокортикоидов, процесс синтеза которых не нарушен. По-видимому, самопроизвольное прерывание беременности у этих женщин обусловлено высоким уровнем андрогенов.

Обсуждение полученных результатов. Недостаточность 21-ОН – широко распространенная аутосомно-рецессивная ферментопатия. Частота гетерозиготного носительства мутантных генов 21-ОН относительно высока и составляет 1:100 – 1:1000, а в отдельных этнических популяциях (евреи, эскимосы) – 1:30 [11].

Исследователи [10] отмечают достоверно более высокий уровень 17-ОП, К и ДГЭА-С у больных СПКЯ в ответ на введение АКТГ по сравнению со здоровыми женщинами. Одни авторы полагают, что это можно трактовать как проявление гетерозиготного носительства гена 21-ОН [1,2]. Другие исследователи считают, что гиперергическая реакция надпочечников пациенток с СПКЯ на АКТГ связана с дефектом другой ферментной системы – цитохрома Р450с17α [11]. По данным Э.Р. Дуринян [2], проводившей пробу с АКТГ 36-часового действия, 67% пациенток с СПКЯ являются гетерозиготными носителями мутантного гена 21-ОН.

Согласно результатам наших исследований, носительство гена недостаточности 21-ОН при расчете дискриминантной функции выявлено только у 28,3% больных с СПКЯ. Эти различия в результатах, по-видимому можно объяснить разными критериями, используемыми для формирования исследуемых групп больных. Однако, мы не можем исключить влияния недостаточности 21-ОН на формирование симптомокомплекса СПКЯ у обследованных больных. Согласно полученным нами данным, даже в группе женщин с СПКЯ, не являющихся носительницами дефектного гена, аткивность 21-ОН достоверно ниже по сравнению с контрольной группой.

Ряд исследователей [7,10] показали, что гиперпродукция андрогенов в надпочечниках связана с функциональными нарушениями ГГНС. В связи с хроническим стрессом, который повышает уровень β-эндорфина. полагают, что гиперпродукция андрогенов при СПКЯ (ЛГ-зависимая в яичниках и АКТГ-зависимая в подпочечниках) модулируется нарушением механизмов ауто-паракринной регуляции стероидогенеза [12].

F. Fruzetti et al. [8] считают, что гиперергическую реакцию 17-ОП, К и ДГЭА-С на введение АКТГ у больных с СПКЯ нельзя трактовать как проявление недостаточности 21-ОН. Они показали, что женщины с СПКЯ дают избыточное повышение уровня 17-ОП и ДГЭА-С не только в ответ на АКТГ, но и при применении α-ГнРГ-нафарелина. Авторами было высказано предположение, что у пациенток с СПКЯ может наблюдаться дизрегуляция цитохрома Р450с17α — основного контролирующего фермента в биосинтезе андрогенов, который катализирует активность 17 α-гидроксилазы и 17,20-лиазы. Так как экспрессия цитохрома Р450с17α обнаружена и в надпочечниках, и в яичниках [12], то его внутренняя патология может объяснить как яичниковую, так и надпочечниковую гиперандрогению у пациенток с СПКЯ. Однако, было показано, что стероидогенный профиль больных с СПКЯ до и после стимуляции АКТГ не связан с дизрегуляций активности цитохрома Р450с17α в надпочечниках [11]. Согласно данным F. Gonzalez и соавт. [9], у 60% женщин имеется дисфункция цитохрома Р450с17α, которая характеризуется относительным снижением активности 17α-гидроксилазы и повышением активности 17,20-лиазы. В связи с этим интересно сообщение, что в геноме членов семей пациенток с СПКЯ выявляется дефект в промоутерном регионе гена СУР17, кодирующего синтез и функцию цитохрома Р450с17α [5,7,11].

Уровень ДГЭА-C через 24 ч превышал исходную величину и уровень через 9 ч во всех группах. В исследованиях Э.Р. Дуринян [2] высказано предположение, что у части больных с СПКЯ наблюдается гиперфункция коры надпочечников, которая проявляется замедленным снижением уровня К после прохождения пика действия АКТГ. Аналогичные данные получены и в нашем исследовании. У пациенток с СПКЯ вне зависимости от носительства гена 21-гидроксилазной недостаточности обнаружено замедленное восстановление исходной концентрации К после введения АКТГ по сравнению с контрольной группой. Возможно, что повышенная чувствительность надпочечников к стимулирующему воздействию АКТГ и более длительный период восстановления нормальной их функции могут служить причиной нарушения репродуктивной функции при различных стрессовых ситуациях, что наблюдалось у больных с СПКЯ.

Таким образом, нарушение овуляции с последующим развитием СПКЯ обусловлено наследственным предрасположением к изменению гипоталамо-гипофизарных структур, мягких дефектов стероидогенеза и функциональной гиперактивностью коры надпочечников. Больные с СПКЯ имеют высокий генетический риск рождения детей с одной из классических форм врожденной гиперплазии коры надпочечников (ВГКН) (сольтеряющей или вирильной). В связи с этим каждой больной СПКЯ необходима медико-генетическая консультация не только с целью диагностики наличия у нее мутаций одним из доступных методов (определение 17-ОП, фенотипа HLA, прямого исследования последовательностей ДНК), но и решения вопроса о последующей пренатальной диагностике.


Список использованных источников:

1. Дзенис И.Г. Современные пути диагностики и профилактики наследственной недостаточности 21-гидроксилазы: Автореф. дис. … д-ра мед. наук. – М., 1995. – 48 с.

2. Дуринян Э.Р. Клинико-патогенетическое обоснование дифференцированного подхода к лечению пациенток с СПКЯ: Автореф. дис. … канд. мед. наук. – М., 1997. – 24 с.

3. Захарова О.И. Функциональное состояние коры надпочечников при физиологическом течении беременности и у беременных групп высокого риска: Автореф. дис. … канд. мед. наук. – М., 1987. – 24 с.

4. Комаров Е.К. Нарушение регуляции функции надпочечников и яичников у женщин с гиперандрогенией (патогенез, диагностика, лечение): Автореф. дис. … д-ра мед. наук. – СПб., 1993. – 48 с.

5. Avivi I. Overdiagnosis of 21-hydroxylase late onset CAN// Fertil. Steril., 1996 – Vol. 4. – P. 557-562.

6. Hypothalami-pituitary-adrenal axis sensitivity to opioids in women with polycystic ovary syndrome/ M. Ciampelli, M. Guido, F. Cicinelli et al.// Fertil. Steril. – 2000. – Vol. 73. – P. 712-716.

7. Escobar-Moreale H. Adrenal androgens in ovarian hirsutism// Fertil. Steril. – 1997. – N4. – P. 654-662.

8. Fruzzetti F. Adrenal androgen secretion in PCOS// Fertil. Steril. 1995. N4. – P. 734-741.

9. Gonzalez F. Heterogeneous adrenal dysfunction in PCOS// Fertil. Steril. – 1996. – N. 3. – P. 354-361.

10. Classification of polycystic ovary syndrome into three types according to response to human corticotrophin-releasing hormone/ J. Kondoh, T Uemura, M. Ishikawa et al.// Fertil. Steril. – 1999. – Vol. 72. – P. 15-20.

11. Role of cytochrome P450c17 in polycystic ovary syndrome/ K.N. Qin, R.Z. Rosenfield.// Mol. Cell. Endocrinol. – 1998. – Vol. 145. – P. 111-121.


02.07.2013 23:09:00