Введение. Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) в современных популяциях человека выходит на одну из лидирующих позиций по частоте. Она диагностируется у 10-30% населения европейских стран, при этом среди лиц с ожирением или сахарным диабетом частота ее достигает 57-74% [1, 2]. Уже не вызывает сомнений наличие связи НАЖБП с такими заболеваниями метаболической природы, как сахарный диабет, ожирение, атеросклероз. Это делает изучение данной патологии актуальным как в аспекте их коморбидных ассоциаций, так и с учетом возможной преморбидной роли поражения печени в их развитии [3, 4].
Доказательная диагностика НАЖБП базируется на гистологическом выявлении в биоптатах печени мелко- либо крупнокапельной жировой дистрофии гепатоцитов [5, 6], которая клинически выражается как стеатоз, стеатогепатит и стеатофиброз, рассматриваемые как единый стадийно протекающий процесс [7]. С большей или меньшей доказательностью обсуждаются разнообразные механизмы развития жировой дистрофии гепатоцитов и присоединения воспалительных явлений с исходом в фиброз органа. Однако триггерные механизмы этих реакций остаются наименее изученными, в том числе и в связи с диагностикой НАЖБП у человека только на этапе уже сформированных патологических состояний органа.
Указанные факты делают весьма актуальной проблему изучения морфологических изменений в печени, начиная с ранних стадий формирования НАЖБП, что с учетом необходимости выполнения пациентам повторных инвазивных биопсий печени не выдерживает критики с этических позиций (соотношение «польза−вред»). Выходом из положения представляется поиск такой адекватной экспериментальной модели развития жировой дистрофии органа у лабораторных животных, при которой легко будет просматриваться начальная «точка отсчета» дистрофических изменений и само их формирование будет происходить достаточно быстро.
В этом качестве есть смысл изучить влияние тиреоидэктомии на особенности формирования патоморфологических процессов в печени крыс. Механизм биологического действия гормонов щитовидной железы реализуется через связывание с ядерными рецепторами (TR) α и β на уровне генома, хотя известно и их негеномное влияние (на мембрану клетки, цитоплазму и митохондрии) [8]. Наблюдаемые при выключении тиреоидной функции метаболические нарушения касаются преимущественно углеводного и липидного обмена. Накоплено достаточно доказательств, свидетельствующих о наличии связи тиреоидного статуса и инсулинорезистентности [8, 9]. В то же время данные о его взаимосвязи с морфофункциональным состоянием печени представлены в основном единичными клиническими наблюдениями поражения печени при снижении тиреоидной функции [10-12].
Цель исследования: изучить особенности формирования и морфологические характеристики поражения печени крыс в разные сроки после тиреоидэктомии в качестве воспроизводимой модели экспериментальной жировой болезни печени.
Материалы и методы. Исследование выполнено на 40 лабораторных крысах-самках нелинейной породы массой 140-160 г. Содержание животных и постановка эксперимента проведены в соответствии с требованиями приказов № 1179 МЗ СССР от 11.10.1983 г. и № 267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., а также международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals». Животные были распределены на 2 группы: 1-я (исследовательская - 20 особей), в которой проводилась тотальная тиреоидэктомия; 2-я (группа контроля - 10 особей), в которой проводилась мобилизация щитовидной железы без тиреоидэктомии. Анестезия осуществлялась путем ингаляции животными паров эфира. После обработки операционного поля производился разрез кожи и разведение краев раны на держалках. Тупым способом разводились мышцы, обнажалась трахея, открывая доступ к щитовидной железе. Электрокоагулятором выполнялась коагуляция щитовидных артерий, после чего иссекались обе доли щитовидной железы и перешеек с дополнительной обработкой коагулятором ложа органа. Результатом проведенных манипуляций являлась тиреоидэтомия, обеспечивающая надежный первичный (послеоперационный) гипотиреоз без необходимости дальнейшего контроля гормонального статуса животного. После завершения вмешательства рана послойно зашивалась капроновыми нитями. Контрольным животным мобилизация щитовидной железы выполнялась по описанной выше методике, но без удаления органа. После завершения хирургического вмешательства животные обеих групп помещались в клетки и содержались в стандартных условиях вивария на стандартном рационе.
Выведение животных из эксперимента осуществлялось путем передозировки эфирного наркоза в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609 EEC на сроках эксперимента 4 и 8 недель. Производился забор печени животных, а также осмотр области трахеи в непосредственной топографической близости со щитовидной железой после выполненной тиреоидэктомии для оценки возможности регенерации ткани щитовидной железы. В эти сроки трахея имела нормальное строение, роста тиреоидной ткани на ней выявлено не было.
По стандартным методикам осуществлялась гистологическая проводка полученного материала. Окраска микропрепаратов ткани печени осуществлялась стандартным (гематоксилин-эозин) и специальными красителями: суданом III - для выявления липидов и пикрофуксином по Ван-Гизон - для выявления соединительной ткани.
Результаты. Анализ результатов экспериментального исследования показал, что в контрольной группе животных в срок 4-8 недель обнаруживается типичная морфологическая структура печени. Орган представлен дольками, не имеющими четких границ и разделенными тонкой прослойкой соединительной ткани. Междольковая соединительная ткань печени крысы развита слабо. Паренхима долек образована радиально расположенными вокруг центральной вены печеночными балками. Гепатоциты имеют полигональную форму, цитоплазма выглядит гранулярной и амфофильной с одним, реже двумя ядрами правильной округлой или вытянутой формы. В цитоплазме гепатоцитов содержится гликоген, при окраске суданом III в единичных гепатоцитах выявляются едва различимые липидные капли, расположенные преимущественно перинуклеарно. Портальные тракты представлены триадами: артериола, венула и желчные протоки. Строма портальных трактов содержит единичные макрофаги, гистиоциты, лимфоциты и полиморфно-ядерные лейкоциты. Синусоидальные капилляры внутри долек представляют собой очень мелкие сосуды, стенки их выстланы эндотелием. Лейкоцитарные инфильтраты и соединительнотканные волокна в паренхиме не выявляются.
В исследовательской группе животных к 4-й неделе после тиреоидэктомии в печени крыс обнаружены выраженные дистрофические процессы. Во всех препаратах выявлялась картина белковой (зернистой) дистрофии: гепатоциты выглядели увеличенными в размерах, набухшими, с множеством ацидофильных белковых гранул в цитоплазме, придающих характерный для данного типа дистрофии грубозернистый вид. Ядро в части случаев имело плохо различаемую хроматиновую структуру, в других случаях определялись лишь тени ядер, окрашенные в голубоватый цвет. Границы между клетками определялись неотчетливо.
Помимо зернистой, выявлялась гидропическая дистрофия: резко набухшие гепатоциты с оптически пустой и разряженной цитоплазмой. Контуры клеток хорошо очерчены, ядра расположены преимущественно центрально с явлениями кариопикноза и кариолизиса. Остатки слабоэозинофильной зернистой цитоплазмы располагались вокруг ядер или вдоль клеточных мембран. Гидропическая дистрофия встречалась преимущественно в перицентральных отделах дольки.
К 4-й неделе эксперимента гепатоциты всех крыс содержали липидные капли различного диаметра, преимущественно мелкие. При окраске суданом III хорошо определялись мелкие включения нейтрального жира, расположенные преимущественно перинуклеарно, цитоплазма клеток представлялась как бы равномерно запыленной мелкими зернами, дающими реакцию на жир. При этом ядро оставалось в центре гепатоцита. Такой тип жирового перерождения принято называть мелкозернистым или пылевым. В большинстве образцов ткани печени присутствовали и другие признаки дистрофических изменений − слабая окрашиваемость ядер, распад части клеток. У всех животных жировая дистрофия, имея диффузный характер, была несколько более выражена в перипортальной зоне. Жировые вакуоли выявлялись в 1/3 гепатоцитов, что соответствует первой степени стеатоза. По мнению А.И. Абрикосова и соавт. [13] мелкозернистое ожирение следует называть дегенеративным, так как основой процесса в данном случае является повреждение печеночных клеток.
Уже на 4-й неделе эксперимента в ткани печени, чаще в перипортальной зоне, появлялись фокусы воспалительной инфильтрации, представленные скоплением лимфоцитов и плазматических клеток, напоминая гистологическую картину, характерную для хронического гепатита с минимальной активностью (рис. 1).
Рис. 1. Гепатит минимальной степени выраженности. Окраска: Гематоксилин и эозин. Увеличение ×40.
Признаков фибротизации печени в данный срок не выявлено. Гистоархитектоника органа сохраняла нормальное строение. Обращало на себя внимание расширение синусоидов, что является признаком серозного отека (рис. 2).
Рис. 2. Серозный отёк паренхимы. Окраска: Гематоксилин и эозин. Увеличение ×40.
Эритроциты нередко образовывали столбики, типичные для явлений стаза.
Таким образом, уже на 4-й неделе послеоперационного гипотиреоза в печени крыс четко прослеживались грубые дистрофические изменения на фоне серозного отека - белково-жировая дистрофия с признаками хронического гепатита с минимальной активностью.
На 8-й неделе эксперимента патологические процессы в печени претерпевали ряд изменений в связи с прогрессированием дистрофических нарушений. Признаки белковой дистрофии, сохраняясь, имели большую степень выраженности. Цитоплазма гепатоцитов была резко разрежена, грубо зерниста, определялась гипохромия ядер. В большинстве образцов печени выявлялась гидропическая дистрофия, более выраженная, чем в предыдущий срок наблюдения. Цитоплазма клеток прозрачная, характерен подчеркнутый контур гепатоцитов за счет хорошо различимых мембран.
На фоне сохраняющейся пылевидной дистрофии гепатоцитов выявлялись клетки, цитоплазма которых была полностью заполнена нейтральным жиром (рис. 3).
Рис. 3. Мелкокапельная жировая дистрофия. Окраска: судан III. Увеличение ×40.
В большинстве препаратов отмечалась картина хронического гепатита с минимальной степенью активности, однако в указанные сроки после тиреоидэктомии ее выраженность была больше, чем в срок 4 недели.
Поиск признаков фиброза в ткани печени крыс на препаратах, окрашенных по Ван-Гизон, показал разрастание соединительной ткани, расширение крупных портальных трактов за счет утолщения стромы, формирование соединительнотканных тяжей из триад к центральной вене.
Обсуждение. После проведенной тиреоидэктомии у лабораторных животных со сформировавшимся первичным послеоперационным гипотиреозом в печени выявляются изменения, практически полностью воспроизводящие структурные характеристики НАЖБП при метаболическом синдроме. Уже на 4-й неделе послеоперационного гипотиреоза у крыс имеет место отчетливая картина сочетания диффузной мелкокапельной жировой дистрофии с белковой (зернистой) и гидропической дистрофией гепатоцитов, а также фокусов воспалительной инфильтрации преимущественно в перипортальной зоне. Явления белковой дистрофии прогрессируют к 8-й неделе эксперимента одновременно с появлением начальных признаков фиброза органа.
Указанные закономерности, обнаруживаемые на раннем этапе моделирования НАЖБП, заставляют по-новому оценить совокупность патогенетических механизмов ее развития. Выявленная диффузная мелкокапельная жировая дистрофия печени у крыс с первичным послеоперационным гипотиреозом может быть интерпретирована как следствие развивающейся инсулинорезистентности на фоне полного выпадения тиреоидной функции. В условиях инсулинорезистентности нарастает поток свободных жирных кислот (СЖК) через портальную систему печени и, как результат, происходит накопление нейтрального жира в цитоплазме гепатоцитов [14, 15].
Выявленная у экспериментальных животных белковая дистрофия гепатоцитов требует осмысления с точки зрения механизма, ассоциированного с уменьшением синтеза белков печенью, в том числе, входящих в состав липопротеидов, в результате чего замедляется механизм элиминации липидов из гепатоцитов.
Причинами зернистой дистрофии служат гипоксические состояния, а также различные инфекции и интоксикации [16]. Однако факт их наличия исключен условиями постановки настоящего эксперимента, соответственно, ведущим фактором белковой дистрофии выступает гипоксия, наличие которой при гипотиреозе подтверждено многочисленными исследованиями [17, 18].
На фоне белковой дистрофии нарушается синтез липопротеидов (ЛПНП, ЛПОНП), осуществляющих транспорт холестерина, триглицеридов и фосфолипидов из печени к периферическим тканям, и обеспечивающих элиминацию жировых включений из гепатоцитов, а также ЛПВП, которые проявляют антиатерогенные свойства. Выявление сочетания нарушения липидного и белкового обмена может быть рассмотрено как морфологический субстрат атерогенной дислипидемии, наблюдаемой в большинстве случаев у пациентов с гипотиреозом.
Свойственный гипотиреозу дисбаланс анаболических и катаболических составляющих белкового обмена, в том числе касающийся транспортных и структурных белков, способствует повышению восприимчивости клеток к внешним влияниям (нарушение трансмембранного обмена между клеткой и тканевой жидкостью). Кроме того, наблюдается снижение чувствительности тканей к воздействию катехоламинов, что усугубляет дисбаланс обменных процессов.
Выявленная у животных в эксперименте гидропическая дистрофия по существу является отражением нарушений водно-электролитного и белкового обмена, результирующего изменением интрацеллюлярного коллоидно-осмотического давления. Данный патологический процесс протекает с повреждением мембран гепатоцитов и дестабилизацией мембран органелл, в первую очередь − с активацией гидролитических ферментов лизосом и разрывом внутримолекулярных связей с присоединением воды, поэтому гидропическую дистрофию следует рассматривать как проявление очагового колликвационного некроза.
Помимо некротических процессов уже на 4-й неделе после тиреоидэктомии в печени экспериментальных животных обнаруживаются воспалительно-пролиферативные процессы. Подобные изменения наблюдаются в далеко зашедших стадиях метаболических расстройств, характеризующихся нарушением гомеостаза клетки, и свидетельствует о потенциальной возможности развития гепатита и даже цирроза только при действии эндогенных факторов.
Регистрируемая в условиях послеоперационного гипотиреоза в срок 8 недель отрицательная динамика морфологической картины печени крысы, характеризующаяся дальнейшим прогрессированием дистрофических, некробиотических и воспалительно-пролиферативных процессов, убедительно доказывает связь между морфофункциональным состоянием печени и тиреоидным статусом.
Выводы
- Эксперимент с проведением тиреоидэктомии у крыс воспроизводит морфологическую картину жировой дистрофии печени, соответствующую основным характеристикам изменений, свойственных неалкогольной жировой болезни печени, убедительно доказывая взаимосвязь между морфофункциональным состоянием органа и тиреоидным статусом.
- В ранние сроки после развития послеоперационного гипотиреоза в печени экспериментальных животных имеет место сочетание жировой и белковой дистрофии гепатоцитов с проявлениями колликвационного некроза, гепатита с минимальной активностью и начальными признаками фиброза печени.
- С увеличением срока после тиреоидэктомии наблюдается прогрессирование дистрофических и некротических процессов в гепатоцитах, а также последовательное появление признаков трансформация стеатоза в стеатогепатит и стеатофиброз печени.
- Экспериментальные данные о структурных особенностях печени позволяют прояснить некоторые морфологические и патогенетические аспекты формирования жировой болезни печени при первичном (послеоперационном) гипотиреозе для оптимизации диагностических и лечебных подходов к ведению данной категории больных.