Русский English

Дмитриева М.Л., Тихоновская О.А., Невоструев С.А., Логвинов С.В., Муштоватова Л.С., Красноженов Е.П.

Аутоиммунный компонент при воспалительных заболеваниях придатков матки

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

Хронические воспалительные заболевания органов малого таза (ХВЗОМТ) по данным авторов составляют 60-65% в структуре гинекологической заболеваемости и остаются одним из самых изучаемых вопросов современной гинекологии [7,9]. Проведены научные исследования, посвященные аутоиммунным нарушениям при различной гинекологической патологии, в том числе при ХВЗОМТ [8,19,24,27]. В 1984 г. N. Jerne, C. Milstein, G. Köhler была присуждена нобелевская премия «За теории относительно специфичности в развитии и контроле иммунной системы и открытие принципа продукции моноклональных антител». N. Jerne обосновал «сетевую» теорию регуляции иммунитета, согласно которой в организме здорового человека продуцируются антитела к любым антигенам организма, причем образование аутоантител может нарушаться при воздействии агрессивных факторов, в том числе при воспалении. В 2001 г. P. Barbarino-Monnier предположил, что антиовариальные антитела (АОА) продуцируются при наличии воспалительной реакции и являются причиной развития ановуляторного синдрома. На уровне клеточного ответа при ХВЗОМТ были исследованы цитокины, синтезируемые T-хелперами, которые предположительно могут запускать каскад иммунных реакций, ведущих к развитию аутоиммунного процесса [11,14,18]. Выявление аутоиммунного компонента при ХВЗОМТ ограничиваются исследованиями иммунной системы, подтверждая диагноз обнаружением сывороточных антиовариальных антител (АОА) [2,6,8,9].

Ранее в эксперименте на модели аутоиммунного оофорита (АО) (положительное решение о выдаче патента на изобретение № 2010130628 от 2.09.2011) был изучен морфогенез аутоиммунных нарушений [6] и определены концентрации АОА, ингибина B и антимюллеровского гормона (AMH) в сыворотке крови лабораторных животных в различные сроки опыта. Установлено, что формирование аутоиммунного процесса завершается к 30-м суткам эксперимента, а к 60-м суткам обнаруживаются нарушения гормональной функции яичников.

Представляет интерес изучения морфологии аутоиммунных процессов при экспериментальном хроническом воспалении придатков матки (ХВПМ) и сопоставление их с серологическим маркером данной патологии – АОА, а также показателями овариальной недостаточности (ингибином B и AMH).

Цель исследования: провести сравнительный анализ морфологии яичников при воспалении придатков матки и АО в эксперименте и выявить роль аутоиммунных нарушений при ХВПМ.

Материал и методы. Эксперимент выполнен на беспородных половозрелых крысах-самках. На проведение эксперимента получено разрешение Этического комитета ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава №1231 от 21.12.2009 г. в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755). Основная группа животных (n=16) с моделью ХВПМ (патент № 2224297 от 20.02.2004 г.) Группа сравнения (n=13) – животные с моделью АО (положительное решение о выдаче патента на изобретение № 2010130628 от 2.09.2011 г.). Группа контроля (n=5) – интактные животные. Животных выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом на 30-е и 60-е сутки после операции. Для гистологического исследования яичники фиксировали в 12% нейтральном формалине и заливали в парафин. Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону, толлуидиновым синим, по Браше, с помощью постановки ШИК-реакции. Концентрацию АОА, ингибина B и AMH в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) (ООО «ДиаТомПлюс», г. Томск). Для оценки морфологических изменений в яичниках проводили морфометрию в соответствии с руководством Г.Г. Автандилова (1990). Подсчет примордиальных и растущих фолликулов, атретических фолликулов и тел, желтых тел проводили на серийных срезах через каждые 150-200 мкм с использованием окулярной измерительной сетки, представляющей большой квадрат, содержащий 25 точек. Удельный объем определяли согласно фундаментальному принципу стереологии Кавальери-Акера-Глаголева. Статистическую обработку проводили с использованием пакета SPSS® 17.0 (© SPSS Inc.). Анализ полученных данных осуществляли методами описательной статистики с вычислением медианы (Me) и интерквартильного размаха (Q1-Q3). Сравнение средних значений двух выборок выполняли непараметрическим методом (U-тест Манна-Уитни) при ненормальном распределении значений. Различия считали достоверными при p<0,05.

Результаты. При гистологическом исследовании яичников крыс с моделью ХВПМ на 30-е сутки эксперимента в мозговом веществе обнаружены фиброзные изменения, лимфоплазмоцитарные инфильтраты, а также скопления тканевых базофилов с явлениями дегрануляции. Часть растущих фолликулов подвержена дегенеративным изменениям, проявляющимся в виде деструкции и цитолиза овоцита, дискомплексацией и десквамацией фолликулярного эпителия. При исследовании срезов яичников крыс с моделью АО к 30-м суткам эксперимента лимфоплазмоцитарный инфильтрат был распространен на наружный и внутренний слои теки, полностью окружая фолликулы, однако тканевые базофилы обнаруживались лишь в интерстициальной ткани. Овоциты практически во всех фолликулах были разрушены, фолликулярный эпителий дискомплексован.

К 60-м суткам эксперимента в основной группе в корковом и мозговом веществе яичников отмечались склеротические изменения соединительной ткани, однако, наряду с этим встречались тканевые базофилы с явлениями дегрануляции. Лимфоплазмоцитарный инфильтрат достигал коркового слоя, но не окружал полностью растущий фолликул. Фолликулярный аппарат характеризовался деструктивными изменениями фолликулярного эпителия, овоциты в некоторых растущих фолликулах также разрушены. К 60-м суткам экспериментального АО наблюдалась картина полного повреждения растущих фолликулов в виде дискомплексации и десквамации фолликулярного эпителия, деструкции овоцита. Инфильтрат присутствовал вокруг растущих фолликулов, однако в наружном и внутреннем слое теки отмечались явления фиброзирования. Тканевые базофилы также встречали в интерстициальной ткани с редкими явлениями частичной дегрануляции.

Морфоколичественный анализ показал, что удельный объем первичных и вторичных фолликулов основной группы на 30-е сутки не отличался от такового в группе контроля, однако удельный объем вторичных фолликулов был достоверно выше, чем в группе сравнения (табл. 1). К 60-м суткам удельный объем вторичных фолликулов был достоверно ниже в основной группе, по сравнению с группой сравнения и контроля, тогда как удельный объем первичных фолликулов был достоверно меньше в основной группе и группе сравнения в отличие от этого показателя в контроле. Удельный объем третичных фолликулов в срезах яичников основной группы животных не отличался от такового в группе контроля. На 30-е и 60-е сутки удельный объем атретических тел и фолликулов был достоверно выше, чем в группе контроля, как в основной группе, так и в группе сравнения. Однако, удельный объем атретических тел и фолликулов в срезах яичников на 30-е сутки в основной группе был ниже, чем показатель в группе сравнения. Удельный объем желтых тел в основной группе был ниже лишь на 30-е сутки, однако к 60-м суткам уже не отличался от контроля. В группе сравнения данный показатель был достоверно ниже контрольного во все сутки эксперимента.

Таблица 1. Удельный объем генеративных элементов яичников при хроническом воспалении придатков матки и экспериментальном аутоиммунном оофорите в различные сроки эксперимента, % (Me (Q1-Q3)).

Таблица 1. Удельный объем генеративных элементов яичников при хроническом воспалении придатков матки и экспериментальном аутоиммунном оофорите в различные сроки эксперимента, % (Me (Q1-Q3)).

Примечания: здесь и далее * - p≤0,05, критерий Манна-Уитни при сравнении с группой контроля; ^ - p≤0,05, критерий Манна-Уитни при сравнении с группой сравнения

При ХВПМ к 60-м суткам зарегистрированы нарушения роста фолликулов в виде уменьшения образования первичных и вторичных фолликулов. При формировании АО к 30-м суткам также происходит снижение удельного объема вторичных фолликулов. Однако, к 60-м суткам наблюдается избыточное образование вторичных фолликулов, удельный объем первичных фолликулов достоверно отличается от данного показателя в контроле.

Сравнительный анализ концентрации АОА выявил, что к 30-м суткам эксперимента в группе с моделью ХВПМ данный показатель был достоверно выше, чем в группе контроля, однако не достигал такого высокого значения, как в группе с моделью АО (табл. 2).

Концентрация ингибина B в группе сравнения достоверно возрастала к 60-м суткам в 3 раза, тогда как концентрация ингибина B в основной группе была значимо ниже на 30-е сутки и не отличалась от контроля к 60-м суткам эксперимента. Концентрация AMH в основной группе и на 30-е, и на 60-е сутки эксперимента была достоверно выше данного показателя в группе контроля, тогда как уровень AMH в сыворотке крови животных с моделью АО достоверно не отличалась от такового в контроле (табл. 2).

Обсуждение. При экспериментальном ХВПМ обнаруживаются все морфологические признаки хронического воспалительного процесса, а на 60-е сутки моделирования в корковом веществе выявляются очаги лимфоплазмоцитарного инфильтрата, который является основным диагностическим признаком АО. Вместе с тем, инфильтрат не окружает полностью фолликул, как это происходит на 30-е сутки экспериментального АО. О наличии аутоиммунного компонента также свидетельствуют характерные изменения удельного объема первичных и вторичных фолликулов. Только при АО уменьшение данного показателя отмечается к 30-м суткам эксперимента, а при моделировании ХВПМ лишь к 60-м суткам.

Таблица 2. Концентрация АОА, ингибина B и AMH в сыворотке крови (ИФА) крыс с моделью ХВПМ и АО, (Me (Q1-Q3))

Таблица 2. Концентрация АОА, ингибина B и AMH в сыворотке крови (ИФА) крыс с моделью ХВПМ и АО, (Me (Q1-Q3))

Концентрация АОА в сыворотке животных с моделью ХВПМ достоверно выше, чем в группе контроля, но при сравнении с показателями группы сравнения (экспериментальный АО) значительно ниже. Таким образом, при сопоставлении морфологических изменений в яичниках двух моделей, а также концентрации АОА, можно предположить вероятность развития начальных проявлений АО при моделировании ХВПМ.

Согласно современной концепции, при АО концентрация ингибина B в сыворотке высокая и не соответствует типичной картине овариальной недостаточности яичников [3,23,26,30]. Повышенная концентрация ингибина B может свидетельствовать о том, что инфильтрации и дегенеративным изменениям при АО на начальных этапах развития данной патологии подвергается тека – основной источник продукции предшественников эстрадиола в яичнике, тогда как клетки гранулезы остаются способными продуцировать ингибин B [30]. Причем в условиях дефицита эстрадиола происходит повышение фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Ингибин B является антагонистом ФСГ и поэтому начинает синтезироваться в большем количестве [4,25]. В проведенном эксперименте при моделировании АО уровень сывороточного ингибина B к 60-м суткам в 2-3 раза превышает таковой в контроле. Также, к 60-м суткам значительно возрастает удельный объем вторичных фолликулов, следовательно, и клеток гранулезы, способных синтезировать ингибин B. Вероятно, избыточный синтез ингибина B происходит в условиях повышенного ФСГ, так как морфологически выявлены дегенеративные изменения текальной оболочки. Однако, механизм такого ответа яичников на происходящие аутоиммунные изменения требует дальнейшего исследования.

При моделировании ХВПМ повреждение фолликула морфологически проявляется одновременным поражением практически всех слоев фолликула. Концентрация ингибина B в сыворотке крови животных с моделью ХВПМ к 30-м суткам меньше, чем таковая в контроле. Такие показатели ингибина B укладываются в типичную картину овариальной недостаточности по классическим представлениям. Но к 30-м суткам происходит только усиление атретических процессов без сокращения удельного объема первичных и вторичных фолликулов. Тогда как при уменьшении удельного объема первичных и вторичных фолликулов к 60-м суткам, концентрация ингибина B в сыворотке животных основной группы достоверно не отличается от указанного показателя в контроле, однако медиана показателя всё же ниже, чем в контроле. Поэтому можно предположить, что при моделировании ХВПМ концентрация ингибина B снижается к 30-м суткам за счет повреждения клеток гранулёзы, как источника продукции данного маркера, а также за счет уменьшения удельного объема первичных и вторичных фолликулов к 60-м суткам эксперимента [13].

Значение и функции AMH в современной литературе представлены несколькими гипотезами [4,10,20,22,23,25] и к настоящему времени роль AMH в репродуктивной функции не имеет единой концепции [21]. Согласно данным исследований AMH является димерным гликопротеином и вырабатывается клетками гранулезы исключительно преантральных (первичный и вторичный) и малых антральных фолликулов [28]. Главным образом, функцию AMH определяют в качестве вещества, участвующего в процессах начального и циклического рекурутирования фолликулов [29]. Предполагают, что AMH играет роль ингибитора при первичном рекрутировании фолликулов, а также модифицирует рост преантральных и малых антральных фолликулов, снижая их ответ на ФСГ [15,16]. Считают, что при снижении доли первичных и вторичных фолликулов в яичнике, показатели сывороточного AMH уменьшаются [4,10,13].

У животных с экспериментальной моделью ХВПМ концентрация AMH в сыворотке крови приобретает высокое значение. Удельный объем предположительных источников синтеза AMH – первичных и вторичных фолликулов снижается, как за счет процессов атрезии, так и за счет образования третичных фолликулов. Сокращение удельного объема вторичных фолликулов может свидетельствовать о снижении ответа клеток гранулезы на ФСГ под действием избыточной продукции AMH, то есть нарушаются процессы циклического рекрутирования фолликулов [13,17].

Таким образом, моделирование ХВПМ приводит к овариальной недостаточности, возможно развивающейся на фоне подавления ответа клеток гранулезы вторичных фолликулов на ФСГ в условиях повышенного образования AMH. Увеличение концентрации АОА, достоверно отличающейся от данного показателя в контроле, свидетельствует о запуске аутоиммунных процессов при данной патологии. Отсутствие характерных морфологических признаков АО можно объяснить недостаточной продолжительностью эксперимента. Возможно, в отдаленные сроки присоединиться выраженный клеточный ответ на агрессивное воздействие в условиях моделирования ХВПМ.

Так как функции и значение ингибина B и AMH до конца не определены, использовать эти маркеры самостоятельно при диагностике овариальной недостаточности не представляется возможным. Требуются более подробные исследования данных веществ как на экспериментальных моделях при различных патологических состояниях женской репродуктивной системы, так и в клинических исследованиях, в том числе на ультраструктурном уровне. Особое внимание заслуживает выявление и изучение конкретного источника AMH в гранулезном слое фолликула.


Список использованных источников:

1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. - М.: Медицина, 1990. – 384 с.

2. Аутоиммунный оофорит (патогенез, диагностика, перспективы лечения)/ Э.К. Айламазян, К.А. Габелова, А.М. Гзгзян, В.В. Потин// Акушерство и гинекология. – 2002. - №2. – С. 7-9.

3. Аутоиммунный оофорит (патогенез, клиника, диагностика, лечение)/ К.А. Габелова, А.М. Гзгзян, В.В. Потин, В.В. Рулев; ред. Э.К. Айламазян. – СПб.: Н-Л, 2010. – 32 с.

4. Гузов И.И. Овариальный резерв и паракринный яичник. – М., 2009.

5. Морфофункциональное состояние яичников при экспериментальном аутоиммунном оофорите/ М.Л. Дмитриева, О.А. Тихоновская, Н.В. Теплова, С.А. Волгушев, С.А. Невоструев, С.В. Логвинов// Мать и дитя в Кузбассе. 2011. Спецвыпуск № 1. – С. 205-209.

6. Патогенез и диагностика аутоиммунного оофорита/ В.В. Потин, Е.Е. Смагина, А.М. Гзгзян, В.В. Рулин, Т.Г. Иоселиани// Журналъ акушерства и женскихъ болезней. – 2000. – Т. 49, №2. – С. 59-66

7. Гинекология: Руководство для врачей/ В.Н. Серов, Е.Ф. Кира, И.А. Аполихина, И.Б. Антонова и др.; под ред. В.Н. Серова, Е.Ф. Кира. – М.: Литтерра, 2008. – 840 с.

8. Аутоиммунный оофорит воспалительного генеза и репродуктивная функция/ В.Н. Серов, М.В. Царегородцева// Акушерство и гинекология. – 2009. - №1. – С. 32-35.

9. Царегородцева М.В. Патогенетические аспекты формирования аутоиммунного оофорита при хронических воспалительных заболеваниях органов малого таза и его восстановительная терапия// Аг-инфо. – 2007. - №2. – С. 32-36.

10. Almeida J., Ball B.A., Conley A.J., Place N.J., Liu I.K., Scholtz E.L., Mathewson L., Stanley S.D., Moeller B.C. Biological and clinical significance of anti-Mullerian hormone determination in blood serum of the mare// Theriogenology. – 2011. – Vol. 76, №8. – P. 1393-1403

11. Bagavant H., Adams S., Terranova P., Chang A., Kraemer F.W., Lou Y., Kasai K., Luo A.M., Tung K.S.K. Autoimmune ovarian inflammation triggered by proinflammatory (Th1) T cell is compatible with normal ovarian function in mice// Biology of reproduction. – 1999. - №61. – 635-642

12. Barbarino-Monnier P. From pathological diagnosis to ovulation induction. The case of ovarian insufficiency// Gynécologie, obstétrique & fertilité. – 2001. – Vol. 29, №1. – P. 39-48

13. Broekmans F.J., Soules M.R., Fauser B.C. Ovarian Aging: mechanisms and clinical consequences// Endocrine reviews. – 2009. – Vol. 30, №5. – P. 465-493

14. Carnaud C., Bach J.F. Cellular basis of T-cell autoreactivity in autoimmune disease// Immunol res. – 1993. – Vol. 12, №2. – P. 131-148

15. Durlinger A.L.L., Visser J.A., Themmen A.P.N. Regulation of ovarian function: the role of anti-Mullerian hormone// Reproduction. – 2002. - №124. P. 601-609

16. Durlinger A.L.L., Gruijters M.J.G., Kramer P., Karelas B., Ingraham H.A., Nachtigal M.W., Uilenbroek J.T.J., Grootegoed J.A., Themmen A.P.N. Anti-Mullerian hormone ingibits initiation of primordial follicle growth in the mouse ovary// Endocrinology. – 2002. – Vol. 143, №3. – P. 1076-1084

17. Haller-Kikkatalo K., Salumets A., Uibo R. Review on autoimmune reactions in female infertility: antibodies to follicle stimulating hormone// Clinical and developmental immunology. – 2011. – Vol. 2012. P. 15.

18. Hill J.A., Welch W.R., Faris H.M., Anderson D.J. Induction of class II major histocompatibility complex antigen expression in human granulose cells by interferon gamma: a potential mechanism contributing to autoimmune ovarian failure// American journal of obstetrics and gynecology. – 1990. – Vol. 162, №2. – P. 534-540.

19. Hoek A., Schoemaker J., Drexhage H.A. Premature ovarian failure and ovarian autoimmunity// Endocrine reviews. - 1997. - Vol. 18, №1. – P. 107-134.

20. Kevenaar M.E., Meerasahib M.F., Kramer P., van de Lang-Born B.M., de Jong F.H., Groome N.P., Themmen A.P., Visser J.A. Serum anti-Mullerian hormone levels reflect the size of the primordial follicle pool in mice// Endocrinology. – 2006. – Vol. 147, №7. – P. 3228-3234.

21. Loh J., Maheshwari A. Anti-Mullerian hormone – is it crystal ball for predicting ovarian ageing?// Human reproduction. – 2011. – Vol. 26, №11. – P. 2925-2932.

22. Panidis D., Katsikis I., Karkanaki A., Piouka A., Armeni A.K., Georgopoulos N.A. Serum anti-Mullerian hormone (AMH) levels are differentially modulated by both serum gonadotropins and not only by serum follicle stimulating hormone (FSH) levels// Medical hypotheses. – 2011. – Vol. 77, №4. – P. 649-653.

23. Soto N., Iniguez G., Lopez P., Larenas G., Mujica V., Rey R.A., Codner E. Anti-Mullerian hormone and inhibin B levels as markers of premature ovarian aging and transition to menopause in type I diabetes mellitus// Human Reproduction. – 2009. – Vol. 24, № 11. – P. 2838-2844.

24. Thomson J.C., Redwine D.B. Chronic pelvic pain associated with autoimmunity and systemic and peritoneal inflammation and treatment with immune modification// The journal of reproductive medicine. – 2005. – Vol. 50, №10. – P. 745-758.

25. Tsepelidis S., Devreker F., Demeestere I., Flahaut A., Gervy Ch., Englert Y. Stable serum levels of anti-Mullerian hormone during the menstrual cycle: a prospective study in normo-ovulatory women// Human reproduction. – 2007. – Vol. 22, №7. – P. 1837-1840.

26. Tsigkou A., Marzotti S., Borges L., Brozzetti A., Reis F., Candeloro P., Bacosi M.L., Bini V., Petraglia F., Falorni A. High serum ingibin concentration discriminates autoimmune oophoritis from other forms of primary ovarian insufficiency// The Journal of clinical endocrinology and metabolism. – 2008. – Vol. 93, №4. – P. 1263-1269.

27. Vereecke L., Beyaert R., van Loo G. Genetic relationships between A20/TNFAIP3, chronic inflammation and autoimmune disease// Biochemical society transaction. – 2011. – Vol. 39, №4. – P. 1086-1091.

28. Vigier B., Tran D., Legeai L., Bezard J., Josso N. Origin of anti-Mullerian hormone in bovine freemartin fetuses// Journal of reproduction and fertility. 1984. Vol. 70, №2. – P. 473-479.

29. Weenen C., Laven J.S.E., von Bergh A.R.M., Cranfield M., Groome N.P., Visser J.A., Kramer P., Fauser B.C.J.M., Themmen A.P.N. Anti-Mullerian hormone expression pattern in the human ovary: potential implications for initial and cyclic follicle recruitment// Molecular human reproduction. – 2004. – Vol. 10, №2. – P. 77-83.

30. Welt C.K., Falorni A., Taylor A.E., Martin K.A., Hall J.E. Selective theca cell dysfunction in autoimmune oophoritis results in multifollicular development, decreased estradiol, and elevated inhibin B levels// The Journal of clinical endocrinology and metabolism. – 2005. – Vol. 90, №5. – P. 3069-3075.


11.01.2012 21:46:00