Русский English

Ащина Л.А., Баранова Н.И., Орлова Е.А., Алешкин В.А., Новикова Л.И., Лютов А.Г.

Изучение влияния препарата Габриглобин на иммунокомпетентные клетки больных хронической аутоиммунной крапивницей в тесте ex vivo

Пензенский институт усовершенствования врачей

Введение. На сегодняшний день хроническая рецидивирующая крапивница (ХРК) занимает одно из ведущих мест в аллергопатологии и представляет собой сложную медико-социальную проблему [8]. В структуре ХРК выделяют аутоиммунную форму (ХАК), которая по данным разных авторов составляет от 30 до 50% [10, 12]. Пациенты с аутоиммунным механизмом развития крапивницы имеют наиболее тяжелое течение заболевания и с трудом поддаются лечению. Иммунные механизмы с участием цитокинов играют главную роль в патогенезе ХАК и до настоящего времени остаются мало изученной проблемой. Известно, что при аутоиммунных заболеваниях происходит активация CD4+ популяции по типу Th1, которая характеризуется избыточным синтезом интерферона-гамма (ИФН-γ) и ИЛ-17 [11]. Высокие концентрации ИФН-γ могут запускать аутоиммунный процесс и оказывать регулирующее действие на рецепторы клеток-мишеней [14]. Противоположным действием обладает ИЛ-10, который подавляет этот процесс и участвует в реакциях аутоиммунитета [16]. Участие в патогенезе ХАК ИЛ-18 доказано в плане фактора, высвобождающего гистамин [15]. В настоящее время актуальным направлением в лечении больных с аутоиммунным механизмом крапивницы является применение внутривенных иммуноглобулинов, одним из которых является отечественный препарат Габриглобин. Однако влияние данного препарата на иммунокомпетентные клетки (ИКК) больных ХАК не изучено. В последние годы проводятся многочисленные исследования с применением тестов ex vivo с целью изучения влияния лекарственных препаратов на состояние клеток иммунной системы, прогнозирования развития аллергических заболеваний [5, 6]. Метод ex vivo по мнению большинства исследователей должен занять центральное место в современной иммунодиагностике [9]. Преимуществами данного метода перед методами in vitro является использование цельной крови без выделения клеточных культур, что упрощает методику анализа и снижает нежелательную активацию или гибель клеток. Также, культивирование клеток крови идет в более естественном окружении, сохраняется баланс всех гуморальных факторов, что соответствует условиям in vivo.

Цель работы. Отработка диагностически значимой дозы препарата Габриглобин для оценки влияния данного препарата на продукцию цитокинов ИКК у больных ХАК.

Материалы и методы. В исследование было включено 22 пациента с хронической аутоиммунной крапивницей до и после лечения препаратом Габриглобин. Средний возраст пациентов составил 47±12 лет. В контрольную группу вошло 15 здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту с основной группой. Диагноз ХАК устанавливался на основании жалоб, данных анамнеза, клинической картины, длительности заболевания, анализа данных сопутствующих заболеваний. Для подтверждения диагноза всем пациентам ставилась проба с аутосывороткой [13]. В исследование были взяты пациенты, имеющие положительную пробу с аутосывороткой диаметром 7 мм и более, которая является диагностическим критерием ХАК [4]. Подбор диагностически значимой дозы Габриглобина производился на 15 здоровых донорах методом ex vivo, в основе которого лежала запатентованная работа Исаченко Е.Г. о способе оценки резервных возможностей ИКК [7]. Критерий, по которому подбиралась диагностически значимая доза Габриглобина был процент здоровых людей с максимальной выработкой цитокинов ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и ИФН-γ ИКК [2]. В работе были использованы концентрации Габриглобина 1:1, 1:3, 1:10. Пациентам до и после лечения препаратом Габриглобин был проведен тест ex vivo с диагностически значимыми концентрациями данного препарата.

Способ осуществления метода ex vivo

1 этап – забор крови. Кровь отбирали из локтевой вены в стерильную силиконизированную пробирку с гепарином. Далее кровь разбавляли в 5 раз стерильной питательной средой 199 с глутамином («Биолот», Санкт-Петербург).

2 этап – инкубация крови, стимулированной Габриглобином для выработки ИКК цитокинов ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и ИФН-γ. Для этого в 3 пробирки добавляли по 675 мкл разбавленной в 5 раз крови, далее в 1-ю пробирку - 75 мкл Габриглобина в концентрации 1:1, во 2-ю – 75 мкл Габриглобина в концентрации 1:3, в 3-ю – 75 мкл Габриглобина в концентрации 1:10. Пробирки инкубировали в термостате в течении 6 часов при 37°С. Затем охлаждали и центрифугировали 5 минут при 800g. Супернатант отбирали и замораживали при -20°С.

3 этап – определение концентрации цитокинов ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и ИФН-γ в супернатанте методом иммуноферментного анализа наборами ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Статистическая обработка результатов проводилась на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ «STATISTICA 6.0». Качественные переменные описывались абсолютными и относительными частотами, количественные переменные представлялись в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха от 25 до 75%. Сравнение количественных признаков в независимых группах проводили по методу Манна-Уитни, в зависимых – с использованием критерия Вилкоксона. Результаты считали достоверными при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. В ходе работы были получены следующие результаты. Как видно из данных табл. 1, у 67% здоровых людей максимальная выработка ИКК ИЛ-10 наблюдалась при концентрации Габриглобина 1:3, у 22% - при концентрации 1:10 и лишь у 11% при концентрации препарата 1:1. Из этого следует, что оптимальной концентрацией Габриглобина для выработки ИКК ИЛ-10 является концентрация 1:3. При изучении показателей выработки ИКК ИЛ-17 было установлено, что у 50% здоровых людей максимальная выработка ИКК достигалась при концентрации Габриглобина 1:3, у 30% - при концентрации Габриглобина 1:1 и у 20% - при концентрации 1:10. Поэтому, оптимальную концентрацию Габриглобина для выработки ИКК ИЛ-10 составляет концентрация 1:3. Также в работе было установлено, что у 70% здоровых доноров максимальная продукция ИКК ИЛ-18 наблюдалась при концентрации Габриглобина 1:10, у 20% - при концентрации 1:1 и лишь у 10% - при концентрации 1:3. Из это следует, что диагностически значимой концентрацией Габриглобина по выработке ИКК ИЛ-18 является концентрация 1:10. При исследовании показателей продукции ИФН-γ было выявлено, что оптимальной концентрацией Габриглобина является концентрация 1:3, так как у 60% здоровых людей максимальная продукция этого цитокина ИКК была именно при концентрации Габриглобина 1:3 и лишь у 40% - при концентрации 1:10.

Таблица 1. Отработка диагностически значимых доз препарата Габриглобин в тесте ex vivo на здоровых людях

Таблица 1. Отработка диагностически значимых доз препарата Габриглобин в тесте ex vivo на здоровых людях

Таким образом, при изучении показателей продукции ИКК ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и ИФН-γ было выявлено, что диагностически значимая концентрация Габриглобина для выработки ИЛ-10, ИЛ-17, ИФН-γ составила концентрация 1:3, а для ИЛ18 – концентрация 1:10.

Следующим этапом работы было изучение влияния диагностически значимых доз препарата Габриглобин на выработку ИКК цитокинов ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и ИФН-γ у больных ХАК в сравнении с показателями цитокинов у здоровых людей. Как видно из данных табл. 2, в группе больных ХАК наблюдался достоверно более высокий уровень ИЛ-17 (р=0,00123). Это согласуется с данными об участии ИЛ-17 в развитии аутоиммунной патологии и о повышенном уровне данного цитокина у больных ХАК [3, 16]. При изучении показателей цитокинов ИЛ-10, ИЛ-18 и ИФН-γ в группе больных по сравнению с контрольной группой достоверных различий выявлено не было.

Следующим разделом работы было сравнительное исследование изучаемых цитокинов с диагностически значимыми концентрациями Габриглобина у больных ХАК до и после лечения данным препаратом. Согласно полученным результатам (таблица 2) было выявлено достоверное снижение уровня ИЛ-10 (р=0,0277) в группе больных ХАК после лечения препаратом Габриглобин по сравнению с группой больных до лечения. Этот факт можно объяснить тем, что после лечения препарат Габриглобин способствует связыванию и изменению свойств иммунных комплексов, а также выведению патологических аутоантител при аутоиммунной патологии [1]. При изучении показателей цитокинов ИЛ-17, ИЛ-18 и ИФН-γ у больных ХАК до и после лечения препаратом Габриглобин достоверных различий выявлено не было.

Таблица 2. Сравнительная оценка влияния диагностически значимых доз препарата Габриглобин на выработку цитокинов ИКК у больных ХАК до и после лечения данным препаратом и здоровых лиц

Таблица 2. Сравнительная оценка влияния диагностически значимых доз препарата Габриглобин на выработку цитокинов ИКК у больных ХАК до и после лечения данным препаратом и здоровых лиц

Примечания: *- достоверность различий показателей цитокинов у больных до лечения и здоровых людей; ** - достоверность различий показателей цитокинов у больных до и после лечения

Выводы

1. Отработана диагностически значимая концентрация препарата Габриглобин для ИЛ-10, ИЛ-17, ИФН-γ в тесте ex vivo, которая составляет 1:3, а для ИЛ-18 – концентрация 1:10.

2. Сравнительный анализ выработки ИКК ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и ИФН-γ под влиянием диагностически значимых концентраций препарата Габриглобин показал достоверно более высокий уровень ИЛ-17 в группе больных ХАК до лечения по сравнению с аналогичными показателями в группе здоровых лиц.

3. У больных ХАК после лечения препаратом Габриглобин в тесте ex vivo был выявлен более низкий уровень ИЛ-10 по сравнению с больными до лечения.


Список использованных источников:

1. Алешкин В.А., Лютов А.Г., Новикова Л.И., Борисова И.В., Кострова О.М., Волков А.В. Иммуноглобулиновые препараты и их иммуномодулирующее действие// Матер. Всеросс. НПК. 2008. – с. 11-15.

2. Баранова Н.И. Оценка реактивности Т-лимфоцитов к аллергенам Staphylococcus aureus и Candida ablicans у больных с аллергическими заболеваниями дыхательных путей: Дис. … канд. биол. наук. - Пенза-Москва, 1997, 100 с.

3. Бережная Н.М., Сепиашвили Р.И. Семейство интерлейкинов-17// Аллергология и иммунология. 2010. - Т. 11, №3. - С.213-223.

4. Больц Е.А. Методы диагностики аутоиммунной крапивницы и эффективность лечения с использованием отечественного препарата «Габриглобин IgG»: Дис … канд. мед. наук. - Пенза-Москва, 2012, 138 с.

5. Зурочка В.А., Долгушин И.И., Симбирцев А.С.Влияние иммуномодулятора Бестима in vitro на спонтанную и индуцированную продукцию цитокинов IFN?, IL-1?, IL-4, IL-8, IL-10 иммунокомпетентными клетками крови условно здоровых лиц// Цитокины и воспаление. 2007. - Т.6, №1. - С. 31-35.

6. Исаченко Е.Г. Виткина Т.И. Геронина С.А. Потапов В.Н., Бердышев Е.В. Спонтанный и липополисахаридный синтез цитокинов клетоками крови человека в норме и при аллергопатологиях// Иммунология. 1999.- №5.- С. 37-39.

7. Исаченко Е.Г. Способ оценки резервных возможностей иммунокомпетентных клеток// Аллергология. 2006. - №2.- С.44-47.

8. Таха Т.В. Новые возможности в терапии крапивницы. // Российский медицинский журнал. 2011. - №11.- с. 678-682.

9. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний иммунной системы. – М.- 2009.

10. Altrich M.L., Halsey J.F., Altman L.C. Comparison of the in vivo au-tologous skin test with in vitro diagnostic tests for diagnosis of chronic autoimmune urticaria.// Allergy Asthma Proc. 2009. Jan-Feb; 30(1):28-34.

11. Gluck J., Brzoza Z., Rogala B. Flow cytometric analysis of type 1 and type 2 subsets of CD4 and CD8 cells in intermittent allergic rhinitis and chronic ur¬ticaria - methodological aspects// Przegl Lek. 2004. 61(7):802-6.

12. Goh С.L, Tan K.T. Chronic autoimmune urticaria: where we stand?// Indian J Dermatol. 2009 Jul-Sep. 54(3): 269–274.

13. Нide M., Francis D.M., Grattan C.E., Hakimi J., Kochan J.P., Greaves M.W. Autoantibodies against high-affinity IgE receptor as a cause of histamine release of chronic urticaria// N. Engl. J. Med. – 1993. - № 328. – p. 1599-1604.

14. Kweon M., Takahashi I., Kiyono H. New insights into mechanism of in-flammatory and allergic diseases in mucosal tissues// Digestion. 2001; 63:1-11.

15. Ibrahim S.A, Khalifa N.A. Interleukin-18 correlates with dis-ease severity in chr6nic autoimmune urticaria// Egyptian Dermatology Online Journal. 2009 Jun; 5(1): 1.

16. Santos J.K, Azor M.H., Nojima V.Y. etc. Increased circulating pro-inflammatory cytokines and imbalanced regulatory T-cell cytokines production in chronic idiopatic urticaria// Int Immunopharmacol. 2008 oct; 8 (10): 1433-40.

17. Алешкин В.А., Молотилов Б.А., Орлова Е.А., Больц Е.А., Новикова Л.И., Лютов А.Г. Новый подход к лечению хронической аутоиммунной крапивницы// Врач-аспирант, №6.3(55), 2012. – С. 445-451

18. Орлова Е.А., Костина Е.М., Молотилов Б.А., Левашова О.А. Лейкотриеновый статус у больных хронической крапивницей и бронхиальной астмой// Врач-аспирант, №6.2(55), 2012. – С. 323-330


02.02.2013 17:05:00