Иммунная тромбоцитопения (ИТП) является одним из наиболее распространенных аутоиммунных цитопенических заболеваний системы крови, характеризующимся снижением количества тромбоцитов в периферической крови ниже 100х109/л [3]. В зависимости от длительности течения данного патологического процесса, выделяют три фазы болезни – впервые выявленная (первые 3 месяца), персистирующая или затяжная ИТП (продолжительность 3-12 месяцев) и хроническая форма (более 12 месяцев). Такая градация основана на современных международных рекомендациях по диагностике и лечению больных тромбоцитопенией [2, 5].
В основе развития ИТП лежат сложные иммунные механизмы, конечным этапом которых является образование антитромбоцитарных антител, приводящих к снижению тромбоцитов в периферической крови. Процессы деструкции сенсибилизированных иммуноглобулинами кровяных пластинок макрофагами путем опосредованного Fc-рецепторами фагоцитоза происходят в селезенке [1, 4].
Однако, изменения, возникающие в лимфоидном органе в процессе течения ИТП, до сих пор изучены недостаточно. Кроме того, в доступной литературе отсутствуют данные относительно исследования селезенки в зависимости от продолжительности течения заболевания. Следовательно, оценка архитектоники органа с помощью современных методов, таких как иммуногистохимия и компьютерная морфометрия актуальна и может иметь существенное практическое значение. Не исключено, что выявленные изменения селезенки в процессе развития ИТП могут быть использованы как дополнительные критерии мониторинга течения болезни.
Целью работы явился анализ гистологических и иммуногистохимических особенностей структуры белой и красной пульпы селезенки у больных ИТП после спленэктомии в зависимости от фазы патологического процесса.
Выполнено морфологическое и морфометрическое исследование гистологических препаратов селезенки у 38 больных ИТП. Из них впервые выявленная форма заболевания была установлена у 11 обследованных, персистирующая – у 11 пациентов, хроническая – у 16 больных. До удаления селезенки все пациенты принимали глюкокортикоидные гормоны в дозе 1-2 мг/кг массы тела. Сравнительный анализ был осуществлен с образцами селезенки, взятыми от 20 лиц, скончавшихся скоропостижно и не имевших в анамнезе заболеваний системы крови.
Для гистологического исследования послеоперационных селезенок окраски гематоксилином и эозином, а также азур-II-оэзином были осуществлены общепринятыми способами. Иммуногистохимическое окрашивание проводилось с антителами CD3, CD4, CD8, CD20, CD79a, CD68, FVIII и системой визуализации EnVISION, PEROXIDASE (DAB) “Dako” в рабочих разведениях. Морфометрическую оценку результатов проводили в световом микроскопе со встроенной фото- и видеокамерой фирмы “Leica” с помощью программного обеспечения анализа изображений ImageScope Color, версии М с окуляром х10, при объективах х10 и х20. Гистологические срезы оценивались в 20 полях зрения для каждого образца.
С целью статистической обработки применялась программа SPSS for Windows Version 19.0. Для выявления достоверности различий между показателями в сравниваемых группах использовали непараметрические двусторонние критерии Краскела-Уоллеса, Манна-Уитни с учетом поправки Бонферони при множественных сравнениях. Различия считали статистически значимыми при уровне р<0,05. Результаты исследований представлены с указанием медианы, а также нижнего (25%) и верхнего (75%) квартилей для каждой группы. При оценке качественных признаков использовали метод χ2 с поправкой Иетса. В случаях малого числа наблюдений анализ проводился с помощью точного двухстороннего критерия Фишера.
В результате исследования выявлено, что масса удаленных селезенок у больных ИТП составила 159,0 (105,0 – 178,0) г и достоверно не отличалась от таковой в контрольной группе: 122,5 (115,0 – 143,7) г.
При морфометрическом исследовании установлено статистически значимое увеличение площади белой пульпы у всех больных ИТП по отношению к группе сравнения, р=0,024 (табл. 1). При этом наиболее выраженные изменения наблюдались преимущественно у лиц с хронической формой заболевания по сравнению с нормой (р=0,005). У пациентов же с впервые выявленной и персистирующей фазой болезни статистически значимых различий данных показателей установлено не было (р>0,05). Полученные результаты отражают вовлечение белой пульпы при ИТП в патологический процесс и более характерны при затяжном течении.
Таблица 1. Средние значения площади функциональных зон селезенки у больных ИТП в зависимости от длительности течения заболевания, %
Примечание: здесь и далее * – статистическая значимость различий по отношению к данным группы сравнения; ** - статистическая значимость различий между группами больных.
Известно, что структурными составляющими белой пульпы селезенки являются периартериальные лимфоидные муфты (ПАЛМ) - Т-клеточная зона, лимфоидные узелки (ЛУ) - В-клеточная зона и маргинальная зона (МЗ). В ходе проведения более детального их изучения достоверных отличий площадей ПАЛМ у всех больных по сравнению с нормой выявлено не было (табл. 2). Однако было установлено уменьшение их размеров у лиц с впервые выявленной ИТП по отношению к больным с хронической формой заболевания (р=0,030). При анализе распределения Т-лимфоцитов в ПАЛМ (CD3+; CD4+) установлено, что данные клеточные субпопуляции преобладали ближе к центральной артерии, окружая сосуд в виде ободка.
Размеры ЛУ у всех больных также не отличались от группы сравнения (p>0,05). Тем не менее установлено достоверное уменьшение их площади у пациентов с впервые выявленной ИТП по отношению к лицам с хронической фазой заболевания (р=0,030). При морфометрическом исследовании количества ЛУ в 1 поле зрения определено статистически значимое их увеличение у больных ИТП: 1,3 (1,1-1,6) при впервые выявленной; 1,1 (0,8-1,4) у лиц с персистирующей и 1,2 (1,0-1,6) среди пациентов с хронической фазой болезни в отличие от группы сравнения, где среднее их содержание составило 0,9 (0,7-1,2). Более того, ЛУ были преимущественно без реактивных центров. Так, на 938 проанализированных узелков выявлялось 45 (4,8%) герминативных центров. Полученные данные не отличались от нормальных значений (р>0,05), где их показатель составил 2,7%. Однако обращало внимание, что центры размножения полностью отсутствовали у лиц с впервые выявленной ИТП и выявлялись только у больных с более длительным течением заболевания ― персистирующая (9,4%) и хроническая (10,6%) фазы. При изучении клеточного состава ЛУ отмечено, что в данной структурной составляющей белой пульпы превалируют В-лимфоидные элементы (CD20+; CD79a+).
Таблица 2. Средние значения площади структурных компартментов белой пульпы селезенки у больных ИТП в зависимости от длительности патологического процесса, мкм2
При морфометрическом анализе МЗ было отмечено значительное увеличение ее площади у всех пациентов с ИТП по отношению к норме, р=0,0012. При этом, наибольшие изменения выявлены у лиц с более длительным течением заболевания в отличие от лиц с впервые выявленной формой (р=0,007). В процессе иммуногистохимических исследований было установлено преобладание В-клеток (CD20+, CD79а+); Т-лимфоциты (CD3+; CD4+; CD8+) в маргинальной зоне были отмечены в меньшем количестве.
Усиление васкуляризации МЗ и ЛУ было обнаружено в 89,5%. Более выраженные ее признаки определялись в 78,5% случаев. При этом данные структурные изменения не имели зависимости от продолжительности заболевания. Маргинальные синусы в селезенках у всех больных ИТП отсутствовали в 98% ЛУ, по отношению к 4,9% в группе сравнения (р=0,002). Причем, достоверных различий в зависимости от фазы заболевания установлено не было. Учитывая, что именно в МЗ происходит поступление из кровотока в белую пульпу селезенки лимфоцитов с последующей их сортировкой в Т- и В-зоны, а также первичная фильтрация и фагоцитоз антигенов, изменения микроциркуляции приводят к замедлению скорости кровотока. Это, возможно, способствует увеличению вероятности распознавания антигенов крови макрофагами, которые принимают участие в аутоиммунных процессах.
В результате изучения особенностей структуры центральных артерий, было установлено статистически значимое уменьшение толщины их стенок и сужение просвета сосудов, p<0,05 (табл. 3). При этом, выявленные изменения были отмечены вне зависимости от продолжительности течения ИТП. Полученные данные могут свидетельствовать о дистрофии стенки артериол за счет тромбоцитопении, а также дезорганизации соединительной ткани сосудов иммунного генеза.
Таблица 3. Характеристика площади центральных артерий селезенки у больных ИТП в зависимости от длительности течения заболевания, мкм2
При морфометрическом исследовании площади красной пульпы выявлено уменьшение ее объема у всех больных по отношению к норме, р=0,024. Данные нарушения были обусловлены изменениями, выявленными, в большей степени, при хронической ИТП по сравнению с контрольной группой (р=0,007) и пациентами с впервые выявленной формой болезни (р=0,015). У обследованных с впервые выявленной и персистирующей фазой патологического процесса статистически значимых различий исследуемых показателей установлено не было. Полученные результаты сопоставляются с данными, выявленными при морфометрическом анализе белой пульпы селезенки и отражают вовлечение функциональных зон органа в механизмы развития ИТП.
При иммуногистохимической оценке структуры селезенки с помощью Factor VIII (маркер тромбоцитов и эндотелия) установлено, что экспрессия данного антитела отмечалась, преимущественно, в МЗ и вдоль синусоидов красной пульпы у всех пациентов с ИТП. Выявленные изменения отличались от группы сравнения, где положительная реакция наблюдалась, преимущественно, в пульпарных тяжах красной пульпы и вдоль синусоидов. Были установлены изменения стенки синусоидов: у пациентов с впервые выявленной ИТП отмечено умеренное ее утолщение, отек стромы; при персистирующей фазе изменения сосудов носили более выраженный характер, в единичных случаях отмечалось заполнение их просвета ядросодержащими клетками кроветворной ткани. Наиболее существенные изменения были установлены у лиц с хронической ИТП – отек стромы, утолщение и огрубение стенки синусоидов, сочетающиеся со значительной их деформацией (извитость структуры, расширение просвета). Кроме того, в процессе течения болезни синусоиды становились более мелкими, а их количество в 1 поле зрения достоверно увеличивалось: 17,3 (15,2-19,4) при впервые выявленной ИТП; 21,6 (17,2-22,8) у лиц с персистирующей и 27,4 (19,2-34,6) у больных с хронической фазой в отличие от группы сравнения, где среднее содержание составило 12,5 (10,5-15,0).
При изучении системы мононуклеарных фагоцитов (CD68+) установлено повышение содержания макрофагов вдоль синусоидов, отмеченное у всех пациентов ИТП вне зависимости от длительности патологического процесса. У части лиц в большом количестве выявлялись клетки типа липофагов или «пенистых» гистиоцитов. В ЛУ селезенки у больных впервые выявленной ИТП данные клетки были единичными. Для пациентов с хронической фазой заболевания был характерен наиболее высокий процент СD68-экспрессирующих элементов в этой области. Полученные данные, вероятно, отражают патогенетически обусловленные процессы, выраженность которых усиливается в ходе течения болезни.
При исследовании распределения лимфоидных популяций в красной пульпе было отмечено, что оно у пациентов с ИТП не отличалось от нормы. Т- и В-клетки в данной области встречались в небольшом количестве. Изменений по содержанию количества Т- и В-лимфоцитов в зависимости от длительности патологического процесса выявить не удалось.
Таким образом, полученные результаты позволяют сделать выводы о вовлечении селезенки в патогенетические механизмы ИТП. Увеличение площади белой пульпы у лиц с хронической формой, а также повышение количества ЛУ с выраженными реактивными центрами свидетельствует о развитии в лимфоидном органе в процессе течения заболевания более выраженных иммунных реакций. Это, возможно, предопределяет эффективность спленэктомии в более поздние сроки болезни. Изменения МЗ у всех пациентов указывают, что основные иммуноморфологические процессы происходят именно в этой зоне селезенки.
Выявленные признаки нарушения микроциркуляции в синусоидах красной пульпы, ЛУ и МЗ, а также отсутствие маргинальных синусов селезенки влияют на скорость кровотока и распределение тромбоцитов и в значительной степени были более характерны для лиц с хронической ИТП. Возможно, это способствует взаимодействию сенсибилизированных кровяных пластинок с макрофагами и приводит к повышенной деструкции тромбоцитов. Увеличение в ЛУ содержания СD68-экспрессирующих клеток у лиц с длительностью патологического процесса более 12 месяцев, вероятно, свидетельствует о повышенной иммунной активности, характерной для этой категории больных.
В целом, полученные данные отражают нарушения архитектоники селезенки в зависимости от фазы заболевания и развиваются по мере прогрессирования патологического процесса. Все это может найти свое отражение в дифференцированном подходе при выборе тактики лечения больных ИТП.