Цель исследования. Основной целью исследования было определение частоты TaqI, ApaI и FokI у казахского населения.
Материалы и методы. В исследование было включено 100 человек, из них 50 мужчин и 50 женщин коренного населения - казахи. Все участники дали письменное информированное согласие на участие в исследовании. У всех участников исследования был проведен забор венозной крови для анализа с хранением при -20°C. Также был произведен анализ литературных данных, индексированных в таких базах, как MEDLINE, Embase, USNational Library of Medicine's PubMed data base, ISI Web of Knowledge, Google Scholar и e-library.
Результаты и обсуждение. Проблема изучения полиморфизмов остается актуальной с момента первого описания роли аллелей гена VDR. Такие ассоциации были исследованы в европейских популяциях [1], в то время как в азиатских исследованиях полиморфизмов гена рецептора к витамину D встречается недостаточно [2]. В связи с этим актуальным представляется изучение распределения гена VDR в казахской популяции. Полиморфизмом называется генетический вариант, который появляется у, по крайней мере, 1% населения [3]. Эти изменения могут произойти в некодирующей части гена (интроне), поэтому они не влияют на конечный белковый продукт. Изменения в этих регулирующих частях гена затем влияют на степень экспрессии гена, и таким образом на уровень белка. Например, изменения в 5'-промоторе гена VDR может повлиять на паттерны экспрессии и уровни мРНК, в то время как вариации последовательности в 3'-нетранслируемой области этого же гена может повлиять на стабильность мРНК и эффективность трансляции белка. Однако изменения могут иметь место и в экзоне гена, что приводит к изменениям в последовательности белка. Тем не менее, также возможны изменения в экзоне, которые могут и не изменять структуру белка, они называются полиморфизмами [4, 5].
На сегодняшний день было обнаружено более 60 полиморфизмов VDR, которые расположены в промоторах гена, в экзонах 2-9 и в регионе 3'UTR [6, 7]. Анализ важности этих VDR полиморфизма в патогенезе различных заболеваний оказался весьма затруднительным. В результате лишь немногие полиморфизмы этого большого гена были изучены. Большинство из них являются полиморфизмами длинных рестрикционных фрагментов (ПДРФ) с неизвестным функциональным эффектом. В некоторых случаях, было указано, что они могут быть связаны с функциональными полиморфизмами в другом месте гена VDR (или в соседнем гене), что объясняет некоторые наблюдаемые ассоциации [6].
Открытие генетических вариантов, связанных с восприимчивостью к заболеваниям может быть ключом к их профилактике. Однако в настоящее время остается недостаточно изученным тот факт, встречаются ли полиморфизмы статистически значимо чаще у людей, восприимчивых к заболеваниям. Также неясно как они соотносятся друг с другом на генетическом и функциональном уровне.
Наиболее значимыми аллельными полиморфизмами и наличие нескольких полиморфизмов длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) в гене VDR было описано с использованием различных ферментов рестрикции. Примерами таких полиморфизмов являются: TaqI [8], BsmI, EcoRV [9] и ApaI [10]. Все эти ПДРФ расположены между 8 и 9 экзонами и в области ДНК с неизвестной функцией. К другому варианту ПДРФ относится FokI. Этот полиморфизм был описан в начале 90-х годов [11, 12] в экзоне 2 стартового кодона, и не имеет неравновесного сцепления с другими SNP (single nucleotide polymorphism) гена VDR. FokI содержит 2 аллели G и А. У носителей генотипа ff (АА), белок, формирующий рецептор VDR, короче на три аминокислоты (424 аминокислоты), по сравнению с носителями генотипа F (G) (427 аминокислоты). Кроме того было продемонстрировано понижение его эффективности по сравнению с носителями генотипа F. Касаемо BsmI и ApaI, они расположены на интроне (интрон 8) и, следовательно, не должны были быть функциональными сами по себе. Однако эти полиморфизмы находятся в неравновесном сцеплении с полиморфизмом TaqI (у лиц с ТТ генотипом, почти в 100% случаев, наблюдается bb и аа генотипы), который расположен на экзоне (экзон 9), а также с 3'-UTR регионом гена. 3'-UTR регион содержит микросателлитные последовательности poly (A), которые влияют на стабильность mRNA гена VDR или на его трансляционную VDR активность. Полиморфизм TaqI обусловлен заменой нуклеотида T на C, что приводит к замене кодона AUU (изолейцин) на AUG (метионин).
Используя метод секвенирования, было найдено большое количество новых полиморфизмов. В нескольких крупных исследованиях также сообщается об этнической предрасположенности к возникновению генных полиморфизмов VDR [6,13].
Было проведено генотипирование трех наиболее распространенных полиморфизмов VDR (rs731236 (TaqI), rs7975232 (ApaI), rs10735810 (FokI)) в казахской популяции. Частоты генотипов локусов Taq-I, Ара-I и FokI среди казахского населения представлены в табл. 1.
Таблица 1. Распределение генотипов рецептора полиморфизма гена витамина D у казахского населения
В общей группе обследованных участников полиморфизм VDR rs731236 (TaqI), наиболее часто встречался в гомозиготном (wild - дикий тип, немутантный вариант) состоянии ТТ - 73%, гетерозиготный генотип Tt - 23%, а мутантный вариант полиморфизма VDR rs731236 (TaqI) tt встречался всего лишь у 4%. У носителей генотипа tt 4% из 100 наблюдаемых, минеральная плотность костной ткани ниже по сравнению с носителями других генотипов. Полиморфизм ApaI участвует в метаболизме кальция в организме, его экспрессия ассоциирована с состоянием костной ткани, а также с функционированием скелетной мускулатуры. Полиморфизм VDR rs7975232 (ApaI) наиболее чаще встречался в гетерозиготном состоянии - Аа 49% из общей группы. Далее составляет мутантный генотип аа - 40% соответственно. И наименьший процент гомозиготное состояние АА - 11%. Гомозиготное состояние АА снижает минеральную плотность костей и способствует развитию остеопороза, соответственно 11% из 100 наблюдаемых подвержены развитию болезни остеопороза. Полиморфизм VDR rs10735810 (FokI) чаще встречается в гомозиготном состоянии FF - 52%, в гетерозиготном состоянии Ff - 37 %, и наличие мутантного генотипа ff составляет 11%.
Было оценено генотипическое распределение Taq-I, Ара-I и FokI по половой принадлежности были рассчитаны по Критерию согласия χ2 Пирсона, хотя женщины показали высокую частоту Ff по сравнению с мужчинами (21% против 16%), а у мужчин ff генотипом по сравнению с женщинами (8% против 3% соответственно), однако связь между факторным и результативным признаками отсутствует, уровень значимости р>0.05, табл. 2.
Таблица 2. Распределение генотипов по признаку пола
Примечание: здесь и далее * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001.
В анализе, проведенном в [6], показано, что f аллель FokI встречается реже у африканцев по сравнению с европейцами и азиатами, в то время как частота аллеля BsmI B значительно ниже в азиатской популяции по сравнению с другими группами населения (частота полиморфизма FokI f составляет: европейцы 34%, азиаты 51%, африканцы 24%; BsmI B аллель: европейцы 42%, азиаты 7%, африканцы 36%) [14]. С другой стороны, аллель Cdx2, как сообщается, гораздо более распространена среди африканского населения, чем среди европейцев и азиатов (Cdx2 аллель: европейцы 19%, азиаты 43%, африканцы 74%) [15]. Кроме того, высокая частота аллеля ApaI была замечена в азиатской популяции (ApaI аллеля: европейцы 44%, азиаты 74%, африканцы 31%). TaqI и поли (А) полиморфизм встречаются в схожем соотношении, с самым низким процентом в Азии (TaqI Т аллель: европейцы 43%, азиаты 8%, африканцы 31%; поли (А) S аллель: европейцы 41% , азиаты 12%, африканцы 29%) [16].
Частота полиморфизма зависит от этнической принадлежности, несколько полиморфизмов были определены в VDR гена а именно FokI, TaqI, и ApaI следовательно, когда эти частоты сравнивали с помощью критерия χ2 казахского населения с другими популяциями наблюдались достоверные различия.
Таблица 3. Сравнение полиморфизма гена TaqI между казахским населением и различными группами населения
При сравнении Казахстана с американским населением по критерию χ2, Миннесота, Пенсильвания, Мексиканская Калифорния по полиморфизму TaqI, показали достоверные различия с данными населениями (p<0.01). При сравнении с Европейским населением (Франция, Австралия, Швеция и Греция) также показали достоверные различия. В Азии (Иордания, Япония, Китай, Таиланд, Северная Индия, Индия, Сирия, ОАЭ, Турция, Иран) достоверные различия показали со многими странами, кроме Японии и Таиланда.
Таблица 4. Сравнение полиморфизма гена АраI между казахским населением и различными группами населения
При сравнении (табл. 4) полиморфизм ген АраI казахского населения с США по критерию χ2 (Миннесота, Пенсильвания, Мексиканская Калифорния) и Европой (Франция, Австралия, Швеция, Греция) показал достоверные различия (p<0.01). При сравнении с Азией (Иордания, Япония, Китай, Тайланд, Северная Индия, Турция, Иран) достоверные различия показал с Иорданией, Северной Индией и Турцией.
Таблица 5. Сравнение полиморфизма гена FokI между казахским населением и различными группами населения
В табл. 5 по критерию χ2 сравнивалось казахское население с Англией, Францией, Японией, Северной Индией, Индией и ОАЭ по полиморфизму FokI, статистически значимо для ОАЭ (p<0.01).
Заключение. Результаты исследования показывают, что распределение полиморфных локусов TaqI, FokI и ApaI значительно различаются не только в разных популяциях, но и в казахской популяции. Казахская популяция близка по своему генотипу к Японии по всем полиморфизмам, к Тайланду и Китаю по полиморфизму TaqI и ApaI. По полиморфизму FokI схожи со странами - Англия, Франция и Индия.
Таким образом, вышеуказанные данные по этничности и обеспечивает основу для будущих эпидемиологических и клинических исследований. Тем не менее, несмотря на все эти этнические различия в возникновении VDR полиморфизма генов, функциональный эффект определенного полиморфизма, скорее всего, физиологическая роль витамина D считается одинаковой во всех группах [17, 18]. Дальнейшие исследования должны быть продолжены, чтобы структурировать полиморфизм между вариантами VDR и хроническими заболеваниями. Исследования аллелей ассоциации ведутся с несколькими хроническими воспалительными и дегенеративными заболеваниями. В долгосрочной перспективе, описанные исследования могут помочь в определении восприимчивости к различным заболеваниям и клиническом ведении пациентов.