Русский English

Якубович Е.И., Князева Т.Г., Лавникевич Д.М., Евтушенко В.И.

5-аза-дезоксицидин снижает метилирование ДНК в промоторе гена DUSP9 и активирует его транскрипцию в клеточных линиях карциномы почки

ФГБУ РНЦ РХТ Минздрава России, г. Санкт-Петербург

Институт биохимии им. Макса Планка, Мюнхен, Германия

Протеинфосфатаза DUSP9, известная также как MKP-4, относится к подгруппе биспецифических протеинфосфатаз, которые дефосфорилируют, и таким образом инактивируют, митоген активируемые протеинкиназы (МАРК): ЕRK, JNK и p38 [15, 23]. Эти молекулы являются ключевыми модуляторами МАРК-зависимых сигнальных путей в клетке, под контролем которых находятся все основные клеточные процессы, включая пролиферацию, гибель и выживаемость клеток [24]. Различные МКР отличаются по характеру экспрессии на разных стадиях развития, а также по внутриклеточной локализации и субстратной специфичности [10]. Преимущественными субстратами DUSP9 являются ERK1/ERK2 и в меньшей мере p38 [7]. Ген DUSP9 имеет выраженный тканеспецифичный характер экспрессии. Высокий уровень транскрипции гена выявляется только в ткани почки, плаценте и эмбриональной печени [22]. Функциональная роль этой протеинфосфатазы изучена очень мало. На основании данных об ассоциации DUSP9 c развитием диабета, предполагают, что ген может быть вовлечен в поддержание метаболического гомеостаза [6, 27]. Показана ключевая роль DUSP9 в сохранениии плюрипотентного состояния эмбриональных стволовых клеток мыши, что свидетельствует о том, что, помимо MAPК-сигнальных каскадов, ген может быть вовлечен и в регуляцию других клеточных путей [17]. Ряд работ доказывают, что в определенных условиях DUSP9 может выполнять функцию опухолевого супрессора [18, 22].

Результаты исследований, выполненные ранее, свидетельствуют о том, что у человека нарушение функции гена DUSP9 может быть ассоциировано со светлоклеточной карциномой почки. Показано значительное снижение уровня экспрессии этого гена в опухолевой ткани по сравнению с нормальной тканью почки [1, 3, 30]. Выдвинуто предположение, что подавление экспрессии гена может быть одним из ранних событий в развитии светлоклеточной карциномы почки [4]. Роль DUSP9 в онкогенезе почки пока не понятна. Учитывая тканеспецифичный характер экспрессии DUSP9, ограниченный в постнатальном периоде только почкой, можно ожидать, что подавление этого гена ассоциировано с нарушением дифференциального фенотипа клеток эпителия почки. На настоящий момент механизмы регуляции DUSP9 на молекулярно-генетическом уровне не изучены.

Для опухолевых клеток, включая и опухолевые клетки почки, характерны различные эпигенетические нарушения [11, 14, 19]. Одним из ключевых эпигенетических изменений, ассоциированных с канцерогенезом, является метилирование цитозина в составе СpG-динуклеотида. Паттерн метилирования генома в неопластических клетках в сравнении с нормальными клетками отличается тотальным гипометилированием и локальным гиперметилированием CpG–островков, локализованных в регуляторных участках генов [13]. Гиперметилирование промоторных CpG-островков подавляет транскрипцию гена.

В районе гена DUSP9, примыкающем к точке инициации транскрипции, есть СpG-островок. Мы предполагаем, что аберрантное метилирование этого CpG-островка может быть причиной инактивации DUSP9 в опухолевых клетках почки. Ранее нами был исследован статус метилирования этого района в ткани светлоклеточной карциномы, однако корреляции между метилированием и экспрессионной активностью гена мы не обнаружили [2]. В работе был использован метод COBRA, который позволяет оценить статус метилирования только определенных CpG-сайтов [31]. Однако, как известно, на экспрессию генов может оказывать влияние как метилирование определенных одиночных СpG-сайтов, так и плотность метилирования в регуляторном локусе гена [26].

Данное исследование выполнено с целью установить, влияет ли ДНК-метилирование промоторного участка на транскрипцию гена DUSP9 в опухолевых клетках почки. На модели линий карциномы почки человека изучена способность деметилирующего агента 5- азадезоксицитидина восстанавливать функцию гена. Используя метод бисульфитного секвенирования определен статус метилирования индивидуальных CpG-сайтов в районе промотора до и после воздействия ингибирующего агента, и сопоставлен с уровнем мРНК DUSP9.

Материалы и методы

Клеточные линии. В работе использовались клеточные линии карциномы почки 769-Р и ТК10 (ATCC). Клетки культивировали в среде RPMI 164, содержащей 10% FBS, 1% cтрептомицина и пенициллина, 1% глутамина, при 37С в атмосфере 5% СО2. Для воздействия 5-Aza-2´-deoxycytidine (5-Aza dC; Sigma) клетки рассевали в ростовой среде и на следующий день добавляли 5-Aza dC до конечной концентрации 5мкМ или 1 мкМ. Клетки, культивируемые без добавления деметилирующего агента, считали контролем. Культуральную среду и 5-Aza dC меняли каждые 24 часа в течение трех дней. После этого клетки трипсинизировали и собирали для экстракции ДНК и РНК.

ОТ-ПЦР. Для оценки уровня мРНК в клетках использовали метод полуколичественной ПЦР. Нормирование проводили относительно гена домашнего хозяйства tubulin. Тотальную РНК выделяли стандартным методом с использованием кислого гуанидин-тиоцианата. Одноцепочечную кДНК синтезировали в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 2 мкг тотальной РНК, 0.5 мкг олиго (dТ)12-18, 5 мкл 5х буфeра для обратной транскриптазы, 200 ед обратной транскриптазы MMLV («Promega»), по 500 мкМ каждого дНТФ, 25 ед ингибитора РНКаз («Promega»). Реакцию проводили 1,5 часа при 420С. 1 мкл кДНК использовали в реакции ПЦР, содержащей 2,5 мкл х1 буфера для Taq полимеразы без Mg (Литех), 0,25 ед. Taq-полимеразы («Литех»), 400 нМ каждого праймера, 200 мкМ каждого дНТФ, 1.5 мМ МgCl2. Для амплификация фрагмента гена DUSP9 добавляли в реакцию DMSO (5% по объему). В работе были использованы следующие праймеры: tubulin, 5’-AAGTGACAAGACCATTGGGGGAGG-3’ (прямой) и 5’-GGGCATAGTTATTGGCAGCATC-3’ (обратный); DUSP9, 5`-CTTCCCGCCGCCCGAGCTT-3`(прямой) и 5`-GCCCCCGCCCTGGTCGTACA-3`(обратный). Реакцию проводили в амплификаторе AB 9700 (Applied Biosystems) по следующей программе: для tubulin: 950С , 1 мин; затем 20-25 циклов, в зависимости от скорости выхода реакции на плато,- 940С, 30 сек; 550С, 30 сек; 720С, 30 сек. Заключительный цикл – 720С 8 мин. Для DUSP9: 950С, 3 мин; затем 35 циклов: 940С, 1 мин; 600С, 50 сек; 720С, 2 мин. Заключительный цикл – 720С 8 мин. После окончания реакции продукты ПЦР анализировали в 1,2%-ном агарозном геле. Гель сканировали и денситометрировали с помощью цифровой системы EDAS 290 и программы 1D Image Analysis version 3.5 (Kodak Digital Science).

Анализ метилирования. Для выделения ДНК клетки лизировали при 500С в течение ночи в буфере, содержащем 20мМ ТрисHCl pH 8.0, 5мМ ЭДТА pH 8.0, 100мМ NaCl, 1% SDS и протеиназу К (50мкг/мл). После фенол-хлороформной экстракции ДНК осаждали спиртом и растворяли в воде. Бисульфитную модификацию проводили с использованием набора methylSEQrTM (Applied Biosystems), следуя рекомендациям производителя. Амплификацию модифицированной ДНК проводили в 2 раунда. 1 раунд: 2 мкл модифицированной ДНК вносили в реакционную смесь (общий объем 50 мкл), содержащую 5 мкл 10х буфера для Тaq-полимеразы, 1.5 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого дНТФ, 400 нМ каждого праймера и 1 ед. Тaq-полимеразы (Литех). Условия реакции: 950С, 4 мин; затем 25 циклов - 950С 30 сек, 600С 50 сек, 720С 1 мин. Заключительный цикл –720С 4 мин. Использованные праймеры: BSP3-L, 5`–GTT GGG GTG TTA GTG TAG ATT TT–3` (прямой); BSP3-R 5`–AAA ACG CCA CTA CTA CAA CCT A–3`(обратный). По окончании реакции 1 мкл из реакционной смеси использовали в качестве матрицы во втором раунде ПЦР. Состав реакционной смеси и программный режим 2-го раунда амплификации аналогичен 1-му раунду. Праймеры, используемые во втором раунде ПЦР: BSP3-L-nested, 5`–AGA GAA TAG AGG TTT GTA GGT GG–3` (прямой), BSP3-R, 5`–AAA ACG CCA CTA CTA CAA CCT A–3`(обратный). Специфичный ПЦР-продукт выделяли из легкоплавкой агарозы и анализировали.

Для анализа метилирования по методу COBRA амплифицированный фрагмент гидролизовали рестриктазой Bsh1236l (BstUI) (Fermentas), после чего проводили электрофорез в 6% полиакриламидном геле. Визуализацию фрагментов рестрикции проводили в ультрафиолетовом свете после окрашивания геля SYBR Green.

Для анализа метилирования методом секвенирования, очищенные ампликоны клонировали в вектор pTZ57R/T, используя систему для клонирования InsTAclone PCR Cloning Kit (Fermentas). Далее, по пять индивидуальных клонов для каждой пробы секвенировали на капиллярном генетическом анализаторе ABI PRISM 310 (Applied Biosystems), используя набор BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Анализ метилирования проводили с помощью программы QUMA (http://quma.cdb.riken.jp/). При статистической обработке полученных результатов использовали точный двусторонний критерий Фишера. Различия считали статистически значимыми при уровне значимости р< 0.05.

Биоинформационный анализ. В работе использовали интернет-ресурсы базы данных NCBI и UCSC Genome Browser. В качестве референсной последовательности была выбрана нуклеотидная последовательность генома человека NC_000023 (hg19, GRCh37). Поиск потенциальных сайтов связывания с транскрипционными факторами проводили с использованием программы MatInspector search (www.genomatix.de). Для подбора праймеров к исходной и модифицированной последовательностям использовали программы Oligo5.0 и Methyl Primer Express V.1.0 (Applied Biosystems), соответственно.

Результаты и обсуждение.  Для того чтобы выяснить, влияет ли метилирование ДНК на транскрипцию гена DUSP9, клеточные линии карциномы почки обрабатывали Aza dC. Этот аналог цитидина встраивается в ДНК делящихся клеток и необратимо связывает ДНК-метилтрансферазы, вызывая пассивное деметилирование ДНК и реактивацию генов, экспрессия которых была подавлена в результате метилирования [21]. Методом полуколичественной ОТ-ПЦР был определен уровень мРНК DUSP9 в семи линиях карциномы почки человека (A-498, A-704, Caki 1, Caki 2, 769-P, 786-O и TK 10). Только в двух линиях, 769-Р и ТК-10, экспрессия гена была значительно снижена по сравнению с нормальной тканью почки. Эти клеточные линии были использованы в дальнейшем исследовании.

Рис. 1. Анализ влияния 5-азадезоксицитидина на транскрипцию гена DUSP9 в клеточных линиях карциномы почки человека: А – результат электрофореза продуктов амплификации в клеточных линиях TK-10 и 769-P до и после воздействия в течение 72 часов 5- Aza dC в разных концентрациях; В – денситометрическая оценка относительного изменения уровней мРНК DUSP9 в клетках под воздействием 5Aza dC, нормированных по tubulin

Рис. 1. Анализ влияния 5-азадезоксицитидина на транскрипцию гена DUSP9 в клеточных линиях карциномы почки человека: А – результат электрофореза продуктов амплификации в клеточных линиях TK-10 и 769-P до и после воздействия в течение 72 часов 5- Aza dC в разных концентрациях; В – денситометрическая оценка относительного изменения уровней мРНК DUSP9 в клетках под воздействием 5Aza dC, нормированных по tubulin

Клетки 769-Р и ТК-10 были обработаны 5Aza dC в разных дозовых режимах (1 мкМ и 5 мкМ) в течение 72 часов. В обеих клеточных линиях воздействие деметилирующего агента приводило к повышению уровня мРНК гена DUSP9 (рис. 1). Наибольший функциональный эффект наблюдался в клетках 769-Р: 5-Aza dC в концентрации 5 мкМ увеличивал уровень ген-специфичного транскрипта в 10 раз, а в концентрации 1 мкМ -всего в 4,4 раза. В клетках линии ТК-10, напротив, максимальный эффект наблюдался при более низкой концентрации, при этом разница в степени усиления была менее выражена: 5,9 против 3,9 при концентрации 5 мкМ. Линия клеток 769-Р ведет свое происхождение из карциномы почки женщины, а ТК-10 получена из опухоли мужчины. Ген DUSP9 локализован на Х хромосоме. Как известно, в клетках самок млекопитающих одна из двух Х хромосом неактивна. Характерной чертой инактивированной Х хромосомы является умеренное метилирование промоторных CpG-островков [25]. Показано, что ингибирование метилирования ДНК может приводить к реэкспрессии генов с инактивированной Х хромосомы [5]. Возможно, более высокий уровень мРНК DUSP9 в клетках 769-Р связан с биаллельной экспрессией гена, вызванной реактивацией второй Х хромосомы. Таким образом, нами показано, что 5-Aza dC восстанавливает экспрессию гена DUSP9 в опухолевых клетках почки. Это значит, что причиной снижения активности гена в этих клетках являются не генетические факторы, а эпигенетические.

Рис. 2. Метилирование проксимального промоторного участка гена DUSP9 в клеточных линиях и клинических образцах карциномы почки: A – геномная карта исследуемого локуса. CpG-сайты обозначены в виде вертикальных линий. Стрелками F, Fn и R представлено расположение праймеров и выделен амплифицируемый фрагмент гена длиной 315 пар оснований, исследуемый в данной работе. Нуклеотидные позиции каждого из 31 CpG-сайта (-188..+73) пронумерованы относительно точки инициации транскрипции (TSS, +1). Положение сайтов для рестриктазы BstU1 отмечено над последовательностью. Толстой черной линией выделен CpG-островок, 1-й экзон обозначен серой линией. B – анализ метилирования фрагмента в клеточных линиях 769-Р и ТК-10 до и после воздействия 5Aza dC, выполненный методом COBRA. Представлен результат гидролиза фрагментов рестриктазой BstU1. Клетки 769-Р и ТК-10 культивировали 72 часа в присутствии 5 мкМ и 1 мкМ 5 Aza dC, соответственно. C – статус метилирования индивидуальных CpG-cайтов, локализованных во фрагменте 315 пар основа

Рис. 2. Метилирование проксимального промоторного участка гена DUSP9 в клеточных линиях и клинических образцах карциномы почки: A – геномная карта исследуемого локуса. CpG-сайты обозначены в виде вертикальных линий. Стрелками F, Fn и R представлено расположение праймеров и выделен амплифицируемый фрагмент гена длиной 315 пар оснований, исследуемый в данной работе. Нуклеотидные позиции каждого из 31 CpG-сайта (-188..+73) пронумерованы относительно точки инициации транскрипции (TSS, +1). Положение сайтов для рестриктазы BstU1 отмечено над последовательностью. Толстой черной линией выделен CpG-островок, 1-й экзон обозначен серой линией. B – анализ метилирования фрагмента в клеточных линиях 769-Р и ТК-10 до и после воздействия 5-Aza dC, выполненный методом COBRA. Представлен результат гидролиза фрагментов рестриктазой BstU1. Клетки 769-Р и ТК-10 культивировали 72 часа в присутствии 5 мкМ и 1 мкМ 5 Aza dC, соответственно. C – статус метилирования индивидуальных CpG-cайтов, локализованных во фрагменте 315 пар оснований, определенный методом бисульфитного секвенирования. Каждый из 31 CpG-сайтов представлен кружком и расположен в соответствии с его 5´ к 3´-порядком в последовательности гена DUSP9. Белый кружок соответствует неметилированному цитозину, черный – метилированному

В 5'-фланкирующей области гена DUSP9 есть CpG-островок, который захватывает 1 некодирующий экзон (координаты – 296…+ 439 от точки инициации транскрипции). Для того чтобы установить, является ли метилирование этого промоторного островка первопричиной инактивации гена, был исследован характер его метилирования до и после воздействия деметилирующего агента. Анализ метилирования проводили, используя методы COBRA и бисульфитное секвенирование.

Из клеток выделяли ДНК и после модификации бисульфитом натрия амплифицировали фрагмент СpG-островка длиной 315 пар оснований, непосредственно примыкающий к точке инициации транскрипции (-188...+73). Затем амплифицированный фрагмент гидролизовали рестриктазой BstU I, узнающей сайт CGˇCG (рис. 2 A)

Для каждой пробы просеквенировано по пять клонов. Слева приведены результаты бисульфитного секвенирования клеточных линий, справа – парных образцов, полученных от пациенток со светлоклеточной карциномой почки (прилежащая нормальная, N/опухолевая ткань, Т). Уровень метилирования в каждой пробе представлен как процентное отношение количества метилированных CpG-сайтов к общему количеству проанализированных динуклеотидов. * - положение CpG cайта со статистически значимым уменьшением уровня метилирования после воздействия 5- Aza dC (точный критерий Фишера, р=0.048).

В исследуемом локусе находится два cайта для этой рестриктазы. В процессе модификации метилированные цитозины не подвергаются конверсии и остаются цитозинами, в то время как неметилированные превращаются в урацил, который в ходе последующей амплификации заменяется на тимин. Таким образом, амплифицированный фрагмент будет расщепляться только в том случае, если сайты в исходной последовательности ДНК были метилированы. Как видно на рис. 2 В, в обеих линиях после 5-Aza dC увеличивается фракция нерасщепленного фрагмента, что свидетельствует о снижении уровня метилирования в исследуемой области гена.

Для детального анализа изменений в метилировании промоторного участка гена DUSP9 под воздействием 5-Aza dC было использовано бисульфитное секвенирование. Амплифицированные фрагменты из каждой клеточной линии до и после деметилирования были клонированы и для каждого фрагмента выборочно секвенировано по пять клонов (рис. 2 С). Количественно общий уровень метилирования оценивали как процентное отношение числа метилированных CpG-сайтов к числу всех проанализированных CpG-сайтов. В обеих клеточных линиях было выявлено статистически значимое снижение уровня метилирования исследуемого локуса после воздействия 5-Aza dC. В клетках 769-Р уровень метилирования снижался с 40,6% до 12,3% (точный критерий Фишера, р=0). В клетках ТК-10 – с 91,6% до 83,2 % (точный критерий Фишера, р=0,027). При сравнении индивидуальных CpG-сайтов статистически значимые различия в метилировании были выявлены только для одного сайта в позиции -125 в клеточной лини 769-Р (точный критерий Фишера, р=0,048). В клетках ТК-10 таких сайтов не обнаружено. Результаты бисульфитного секвенирования согласуются с данными, полученными методом COBRA. Оба метода показали, что в целом 5-Aza dC снижает уровень метилирования в обеих клеточных линиях, но при этом клеточные линии заметно отличаются по уровню метилирования как до, так и после воздействия 5-Aza dC. В клетках ТК-10 локус гена гиперметилирован, а в клетках 769-Р присутствуют два вида аллелей: гиперметилированные и почти полностью неметилированные аллели. Несмотря на это, в обеих линиях уровень мРНК DUSP9 очень низкий. Характер метилирования в 769-Р может отражать разные аллельные состояния двух Х хромосом в этих клетках: активной и инактивированной. Возможно, исследуемый локус на неактивной Х хромосоме не метилирован, что подтверждают и данные анализа этого участка в нормальной ткани почки у женщин (рис. 2 С). Если бы на инактивированной Х хромосоме исследуемый участок был метилирован, то гиперметилированные аллели выявлялись бы и в нормальной ткани почки. Таким образом, неметилированные аллели в опухолевых клетках могут соответствовать инактивированной Х хромосоме, а гиперметилированные - отражать статус метилирования гена DUSP9 на активной хромосоме.

В клетках ТК-10, обработанных Aza dC, общий уровень метилирования в исследуемом фрагменте, хотя и ниже, чем в исходных, но все равно остается довольно высоким (83,2%). Однако, в отличии от исходных клеток, в них появляются аллели с деметилированными кластерами из пяти CpG-сайтов (-75…-42). Этот же участок наиболее выраженно деметилирован и в клетках 769-Р. Возможно, что статус метилирования этих цитозинов может быть связан с транскрипцией гена. В настоящее время механизмы регуляции экспрессии генов через метилирование ДНК не совсем поняты. Полагают, что эффекты метилирования CpG-сайтов на транскрипцию могут быть опосредованы через белки, которые связываются с метилированными CpG-cайтами и вызывают ремоделирование хроматина путем рекрутирования деацетилаз и репрессоров транскрипции [28]. Возможно и прямое влияние метилирования ДНК на транскрипцию: метилированные цитозины в сайте узнавания стерически препятствуют связыванию с факторами транскрипции, что ингибирует экспрессию генов [8,32]. Анализ исследуемого участка генома, выполненный с использованием программ MatInspector (Genomatix), предсказывает, что в районе -75..-42, могут находится сайты связывания с различными транскрипционными факторами, такими как Egr1, Sp1, MAZ, KKLF, CTCF. Интересно отметить, что в этой группе факторов, которые экспрессируются повсеместно, только KKLF имеет выраженный тканеспецифичный характер экспрессии: высокий уровень этого белка выявляется только в ткани почки и печени [9]. Потенциальный комплексный мотив для связывания со всеми транскрипционными факторами, кроме СTCF, идентифицирован нами и в ортологичных последовательностях. Такая эволюционная консервативность свидетельствует о функционально-значимой роли этого геномного участка. Результаты исследований иммунопреципитации хроматина, представленные в базе данных USCS Genome Browser, экспериментально подтверждают возможность связи хроматина в районе, примыкающем к первому экзону, с транскрипционными факторами CTCF, MAZ, Sp1 и Egr1. Перекрывающиеся сайты связывания для транскрипционных факторов Sp1, Egr1, Maz содержатся в промоторах многих генов, и их взаимодействие является одним из ключевых механизмов в регуляции экспрессии генов [12, 16, 20, 29].

Таким образом, исследование показало, что деметилирование промотора, индуцированное 5-Aza dC, активирует экспрессию гена DUSP9 в опухолевых клетках почки. Это значит, что причиной инактивации гена при светлоклеточной карциноме может быть аберрантное метилирование промоторного CpG-островка. Установлено, что реэкспрессия ассоциирована с деметилированием определенных CpG-сайтов, которые входят в состав мотивов связывания ряда потенциальных транскрипционных факторов. Изучение роли этих транскрипционных факторов в регуляции экспрессии гена DUSP9 является целью дальнейших исследований.

Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» с использованием оборудования ЦКП «Биотехнологический центр исследования экспрессии генома» ФГБУ РНЦРХТ Минздрава России в рамках государственного контракта № 14.512.11.0044.


Список использованных источников:

1. Гранов А.М., Якубович Е.И., Евтушенко В.И. Множественный параллельный анализ экспрессии генов как инструмент молекулярной диагностики рака почки и предстательной железы// Медицинский академический журнал. 2006. Т.6. №1. С. 131-138.

2. Гранов А.М., Якубович Е.И., Лавникевич Д.М., Евтушенко В.И. Гендерные различия в метилировании 5’-фланкирующей области гена DUSP9 у больных со светлоклеточной карциномой почки// Медицинский академический журнал. 2009. Т8. №3. С. 71-76.

3. Чебуркин Ю.В., Князева Т.Г., Петер Ш., и др. Молекулярный портрет карцином почки человека, полученный на основе экспрессии протеин-тирозин-киназ и тирозин-фосфатаз, контролирующих передачу регуляторных сигналов в клетках// Молекулярная биология. 2002. Т.36. №.3 С. 480-490.

4. Якубович Е.И., Евтушенко В.И. DUSP9 - новый driver-ген светлоклеточной карциномы почки?// Врач-аспирант. 2012. №4.3 (53). С. 404-410.

5. Czankovszki G., Nagy A., Jaenisch R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation// J. Cell Biol. 2001. V.153. P. 773–783.

6. Emanuelli B., Eberle D., Suzuki R., Kahn C.R. Overexpression of the dualspecificity phosphatase MKP-4/DUSP-9 protects against stress-induced insulin resistance// Proc Natl Acad Sci U S A. 2008. 105(9). P. 3545-3550.

7. Farooq A., Zhou M.M. Structure and regulation of MAPK phosphatases// Cell Signal. 2004. V.16(7). P. 769-779.

8. Fujimoto M., Kitazawa R., Maeda S., Kitazawa S. Methylation adjacent to negatively regulating AP-1 site reactivates TrkA gene expression during cancer progression// Oncogene. 2005. V.24. P. 5108–5118.

9. Gray S., Feinberg M.W., Hull S. et al. The Krüppel-like factor KLF15 regulates the insulin-sensitive glucose transporter GLUT4// J Biol Chem. 2002. V.277(37). P. 34322-34328.

10. Haagenson K.K., Wu G.S. Mitogen activated protein kinase phosphatases and cancer// Cancer Biol Ther. 2010. Vol.9. №. 5. P. 337-340.

11. Henrique R., Luís A.S., Jerónimo C. The epigenetics of renal cell tumors: from biology to biomarkers// Frontiers in Genetics. 2012. doi: 10. 3389/fgene. 2012. 00094.

12. Her S. Claycomb R., Tai T.C., Wong D.L. Regulation of the Rat Phenylethanolamine N-Methyltransferase Gene by Transcription Factors Sp1 and MAZ// Mol Pharmacol. 2003. V64 (5). P. 1180-1188.

13. Issa J.P. CpG island methylator phenotype in cancer// Nat Rev Cancer. 2004. V.4. P: 988-993.

14. Jones P.A., Baylin S.B. The fundamental role of epigenetic events in cancer// Nature Reviews Genetics. 2002. V. 3 (6). P. 415-428.

15. Keyse S.M. Dual-specificity MAP kinase phosphatases (MKPs) and cancer// Cancer Metastasis Rev. 2008. Vol. 27 (2). P. 253-256.

16. Lawrence J., Chen M., Xiong F. et al. Foetal nicotine exposure causes PKC1 gene repression by promoter methylation in rat hearts// Cardiovascular Research. 2011. V.89. P. 89–97.

17. Li Zh., Fei T., Zhang J. et al. BMP4 Signaling Acts via Dual-Specificity Phosphatase 9 to Control ERK Activity in Mouse Embryonic Stem Cells// Cell Stem Cell. 2012. V. 10 (2). P. 171–182.

18. Liu Y., Lagowski J., Sundholm A., Sundberg A., Kulesz-Martin M. Microtubule disruption and tumor suppression by mitogen-activated protein kinase phosphatase 4// Cancer Res. 2007. V.67 (22). P. 10711-10719.

19. Marcella M.L.L. Baldewijns, Iris J.H. et al. Genetics and epigenetics of renal cell cancer// Biochimica et Biophysica Acta-Reviews on Cancer. 2008. V. 1785 (2). P. 133-155.

20. Méndez-Catalá C.F., Gretton S., Vostrov A., et al. A Novel Mechanism for CTCF in the Epigenetic Regulation of Bax in Breast Cancer Cells// Neoplasia. 2013. V.15 (8). P. 898–912.

21. Mossman D., Kim K-T., Scott R.J. Demethylation by 5-aza-2'-deoxycytidine in colorectal cancer cells targets genomic DNA whilst promoter CpG island methylation persists// BMC Cancer. 2010. V. 10. P. 366 -376.

22. Muda M., Boschert U., Smith A., et al. Molecular cloning and functional characterization of a novel mitogen-activated protein kinase phosphatase, MKP-4// J Biol Chem. 1997. V.272 (8). P. 5141-5151.

23. Patterson K.I., Brummer T., O’Brien P.M., Daly R.J. Dual-specificity phosphatases: critical regulators with diverse cellular targets// Biochem J. 2009. V. 418 (3). P. 475-489.

24. Pearson G., Robinson F., Beers Gibson T., et al. Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways: regulation and physiological functions// Endocr Rev. 200. V.22. P. 153-183.

25. Sharp A.J., Stathaki E., Migliavacca E. et al. DNA methylation profiles of human active and inactive X chromosomes// Genome Res. 2011.V. 21 (10). P. 1592-1600.

26. van Vlodrop I., Niessen H., Derks S. et al Analysis of promoter CpG island hypermethylation in cancer: location, location, location!// Clinical Cancer Research. 2011. V.7. P. 4225–4231.

27. Voight B.F., Scott L.J., Steinthorsdottir V. et al. Twelve type 2 diabetes susceptibility loci identified through large-scale association analysis// Nat Genet. 2010. V.42 (7). P. 579-589.

28. Wade P.A. Methyl CpG-binding proteins and transcriptional repression// Bioessays. 2001. V.23. P. 1131–1137.

29. Williams L.J.S., Abou-Samra A.B. The transcription factors SP1 and MAZ regulate expression of the parathyroid hormone/parathyroid hormone-related peptide receptor gene// Journal of Molecular Endocrinology. 2000. V. 25. P. 309–319.

30. Wu S., Wang Y., Sun L., Zhang Z. et al. Decreased expression of dual-specificity phosphatase 9 is associated with poor prognosis in clear cell renal cell carcinoma// BMC Cancer. 2011. V. 11. P. 413-421.

31. Xiong Z., Laird P.W. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay// Nucleic Acids Res. 1997. Vol. 25. P. 2532–2534.

32. Zhu W.G., Srinivasan K., Dai Z. et al. Methylation of adjacent CpG sites affects Sp1/Sp3 binding and activity in the p21Cip1 promoter// Mol Cell Biol. 2003. V.23. P. 4056–4065.


04.09.2013 17:19:00