Изменение активности лизосомальных цистеиновых протеиназ плазмы и лейкоцитов крови у пациентов с варикозным расширением поверхностных вен нижних конечностей различной клинической тяжести

Рязанский государственный медицинский университет

Лизосомальные цистеиновые протеиназы (ЛЦП), или катепсины, относятся к протеолитическим ферментам, и первоначально были идентифицированы, как протеазы, действующие в лизосомах. Исследования последних лет раскрыли нетрадиционные роли для катепсинов во внеклеточном матриксе, а также в цитозоле и в ядре [6, 10].

В настоящее время активно изучается активность ЛЦП при различных патологических состояниях, в частности при сердечно-сосудистых заболеваниях. Показано, что лизосомальные цистеиновые протеиназы – катепсины L и Н способны секретироваться во внеклеточную среду, где они и обнаруживаются при различной сосудистой патологии [12]. Способность ЛЦП к секреции и наличие данных об участии катепсинов В и L в деградации внеклеточных белков – ламинина, фибронектина, коллагена IV типа [9] заставляет рассматривать данную группу ферментов в качестве одного из наиболее вероятных факторов развития патологии сосудистой стенки.

В настоящее время доказано, что ЛЦП, а также дисбаланс между ЛЦП и их внутриклеточным ингибитором – цистатином С играют одну из ведущих ролей в ремоделировании сосудистой стенки при патологии сосудов – атеросклерозе [7] и аневризме аорты [12]. Тем не менее, участие ЛЦП в патологии венозной системы остаётся практически не изученным.

Последнее десятилетие ознаменовалось значительным прогрессом в развитии методов диагностики и оценки тяжести венозной дисфункции, что позволило получить более глубокие представления о хронических заболеваниях вен нижних конечностей. В настоящее время доказана и не вызывает сомнений роль воспаления в развитии и прогрессировании хронических заболеваний периферических сосудов [9]. В то же время, роль воспаления и его клеточного субстрата – лейкоцитов в повреждении венозной стенки при первичных (не тромботических) формах хронических заболеваний вен и, прежде всего, при варикозной болезни, по-прежнему вызывает научные споры [1]. Тем не менее, всё больше появляется исследований, подтверждающих наличие повышенной адгезии лейкоцитов к стенке варикозно поражённого сосуда [1,8], что в настоящее время объясняют дисфункцией эндотелия с избыточной продукцией молекул клеточной адгезии [2].

В связи с вышеизложенным, актуальным представляется изучение зависимости изменений активности ЛЦП от выраженности клинических проявлений варикозного расширения поверхностных вен нижних конечностей, возможность количественной оценки которых даёт классификация СЕАР [4, 13].

Целью настоящей работы явилось изучение изменений активности лизосомальных цистеиновых протеиназ плазмы и различных фракций лейкоцитов крови у пациентов с варикозным расширением поверхностных вен нижних конечностей в зависимости от клинического класса и интегрированного индекса клинической тяжести.

Материалы и методы. В работе представлены результаты обследования 24-х пациентов с диагнозом «варикозное расширение поверхностных вен нижних конечностей», находившихся на стационарном лечении в клинике сосудистой хирургии ГБОУ ВПО РязГМУ Минздравсоцразвития России в 2011–2012 г. Средний возраст пациентов составил 47,6±13,7 года. Степень тяжести клинических симптомов была оценена по классификации СЕАР от С0 до С5. Согласно этой классификации пациенты были разделены на 3 группы: группа 1 – пациенты С0 – С1, группа 2 – пациенты С2 – С3, группа 3 – пациенты С4 – С5. Кроме того, для каждого клинического случая был рассчитан интегрированный индекс клинической тяжести.

Контрольную группу составили здоровые доноры, забор крови осуществлялся в отделении переливания крови ГБУ РО «Областная клиническая больница». Исследуемые группы были сопоставимы по возрасту и полу.

Для исследования использовали ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) – стабилизированную кровь, взятую из локтевой вены утром натощак. Для выделения различных фракций лейкоцитов эритроциты осаждали 6% раствором декстрана, после чего плазму со взвешенными в ней лейкоцитами подвергали изопикническому центрифугированию на градиенте плотности урографин – полиглюкин. При этом получали две фракции лейкоцитов: интерфазный слой содержал моноядерные лейкоциты, представленные лимфоцитами и моноцитами, осадок – полиморфноядерные гранулоциты. Клетки отмывали 0,15 М раствором хлорида натрия, пропускали через капроновый фильтр, подсчитывали в камере Горяева и гомогенизировали пипетированием через иглу малого диаметра. Активность катепсинов L и Н измеряли в полученном гомогенате спектрофлуориметрическим методом по Barrett & Kirschke [5].

Для оценки статистической значимости межгрупповых различий использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни.

Результаты и обсуждение. Оценка изменений активности катепсинов L и Н в плазме и лейкоцитах крови у пациентов различных классов клинической тяжести по сравнению с контрольной группой выявила ряд статистически значимых отличий (табл. 1).

Активность катепсина L в плазме повышалась у пациентов по сравнению с контролем, причём его повышение оказалось статистически значимым в группе с наименьшей выраженностью тяжести клинических симптомов: группа 1 (С01). В полиморфноядерных лейкоцитах (ПМЯЛ) мы также наблюдали повышение активности катепсина L, статистически значимым оказалось повышение в группах 1 (С01) и 2 (С23). В моноядерных лейкоцитах (МЯЛ) активность катепсина L достоверно снижалась во 2 (С23) и 3 (С45) группах.

Таблица 1. Показатели активности катепсинов L и Н в плазме и клетках крови больных варикозным расширением вен в зависимости от класса клинической тяжести заболевания (M±S)

Таблица 1. Показатели активности катепсинов L и Н в плазме и клетках крови больных варикозным расширением вен в зависимости от класса клинической тяжести заболевания (M±S)

Примечание: * – статистически значимые отличия от контрольной группы (р<0,05).

Активность катепсина Н достоверно повышалась в плазме пациентов с варикозным расширением вен 3 группы (С45) и достоверно повышалась в полиморфноядерных лейкоцитах всех трёх групп пациентов по сравнению с группой контроля, и достоверно снижалась у пациентов всех трёх групп в моноядерных лейкоцитах.

При оценке корреляционной связи активности катепсинов L и Н в плазме и различных фракциях лейкоцитов крови при варикозном расширении вен нижних конечностей с интегрированным индексом оценки тяжести симптомов заболевания с учётом данных клинических проявлений по классификации СЕАР нами было обнаружено следующее.

Корреляционной связи между активностью катепсина L, содержащегося в плазме и лейкоцитах крови, и балльной оценкой степени клинической тяжести по классификации СЕАР обнаружено не было.

Наиболее выраженной оказалась корреляционная связь между активностью катепсина Н в моноядерных лейкоцитах и оценкой СЕАР – средняя cтепень корреляции (r = 0,55).

Корреляция между активностью катепсина Н в полиморфноядерных лейкоцитах и интегральной оценкой по классификации СЕАР оказалась средней (r = 0,49). Также средними оказались корреляционные значения между активностью катепсина Н в плазме крови и интегрированным индексом оценки тяжести симптомов по классификации СЕАР (r = 0,41).

Выводы

  1. Активность лизосомальных цистеиновых протеиназ – катепсинов L и Н у пациентов с варикозным расширением поверхностных вен нижних конечностей меняется разнонаправлено: повышается в плазме и полиморфноядерных лейкоцитах и снижается в моноядерных лейкоцитах.
  2. Активность катепсина L в плазме и полиморфноядерных лейкоцитах достоверно повышается у пациентов с малой степенью клинических проявлений варикозного расширения вен нижних конечностей согласно классификации СЕАР, в моноядерных лейкоцитах достоверно понижается при более развитой симптоматике.
  3. Активность катепсина Н достоверно повышается в плазме у пациентов с варикозным расширением вен с более выраженными поражениями – стадии С45 по классификации СЕАР и в гранулоцитах всех трёх групп пациентов, а также достоверно снижается в моноядерных лейкоцитах всех трёх групп пациентов.
  4. Активность катепсина Н коррелирует с интегрированным индексом оценки степени тяжести симптомов по СЕАР - классификации, что позволяет предположить более активное участие катепсина Н тканей и лейкоцитов в патогенезе варикозного расширения поверхностных вен нижних конечностей.

Список использованных источников:

  1. Богачёв В.Ю., Голованова О.В. и др. Об участии лейкоцитов в патогенезе первичных форм хронических заболеваний вен нижних конечностей// Ангиология и сосудистая хирургия. – 2011. – Т. 17. - № 3. – С. 71–74.
  2. Богачёв В.Ю. Хронические заболевания вен нижних конечностей: от патогенеза к лечению и профилактике// Ангиология и сосудистая хирургия. – 2008. – Т.14. - № 2. – С. 65–72.
  3. Кирпиченок Л.Н. Значение компонентов системы протеолиза в регуляции воспалительных реакций// Медико–биологические проблемы жизнедеятельности. Витебск, 2010. - №2(4). – С. 15–23.
  4. Покровский А.В., Сапелкин С.В. Классификация СЕАР и её значимость для отечественной флебологии// Ангиология и сосудистая хирургия. – 2006. – Т. 12. - № 1. – С.65–74.
  5. Barrett A.J., Kirschke H. Cathepsin B, cathepsin H, cathepsin L//,In Enzymol. – 1981. – Vol. 80. – P.535-561.
  6. Barrett A.J., Rawlings N.D. ‘Species’ of peptidases// Biol Chem. 2007; 388(11):1151–1157.
  7. Eberhardt R.T., Raffetto J.D. Chronic Venous Insufficiency// Circulation. 2005; 111:18; 2398–2409.
  8. Liu J. et al. Increased serum cathepsin S in patients with atherosclerosis and diabetes// Atherosclerosis. – 2006. – 186. – P. 411–419.
  9. Norgren L., Hiatt W.R., Dormandy J. et al. Inter – society consensus for the management of peripheral arterial disease// Int. Angiology. 2007; 26: 81–157.
  10. Puente X.S., Sanchez L.M., Overall C.M., Lopez-Otin C. Human and mouse proteases: a comparative genomic approach// Nat Rev Genet. 2003;4(7):544–558.
  11. Reiser J., Adair B., Reinheckel T. Specialized roles for cysteine cathepsins in health and disease// Science in Medicine. – 2010. – Vol. 120(10):3421–3431.
  12. Cathepsin cysteine proteases in cardiovascular disease / P.M.S.Lutgens et al.// The FASEB Journal. – Vol. 21, October 2007, P. 3029–3041.
  13. Porter J.M., Moneta G.L. International Consensus Committee on chronic venous disease. Reporting standards in venous disease: an update// J. Vasc. Surg. 1995; 21: 635–645.