Введение. Лекарственный гепатит является одним из наиболее часто встречаемых токсических поражений печени. В терапии туберкулеза используется ряд химиопрепаратов, токсично действующих на печень. Известно, что у 15-20% пациентов, получающих противотуберкулезные препараты, отмечается лекарственное поражение печени [6]. Важнейшим патогенетическим фактором в развитии токсического гепатита является действие активных форм кислорода (АФК). При их чрезмерном образовании происходит развитие окислительного стресса, взаимосвязанного с недостаточностью функционирования АОС. К антиоксидантам могут быть отнесены вещества, играющие роль хелаторов ионов металлов с переменной валентностью. К таким веществам – комплексонам относится цитрат. Реакцию превращения цитрата в изоцитрат катализирует аконитатгидратаза (КФ 4.2.1.3: АГ), молекула которой легко разрушается АФК, что позволяет рассматривать данный фермент как чувствительный критерий развития оксидативного стресса.
На сегодняшний день актуальной проблемой является исследование антиоксидантной функции цитрата, способного элиминировать ионы Fe2+, участвующие в образовании одной из наиболее реакционноспособных АФК – гидроксильного радикала, из пероксида водорода в реакции Фентона [11].
Представляет интерес исследование биологически активных веществ, способных активировать АОС и обладающих собственной антиоксидантной активностью. Имеются данные, что такие свойства характерны для гормона, вырабатываемого эпифизом и некоторыми экстрапинеальными тканями – мелатонина. Данный гормон принимает участие в синхронизации сезонных и суточных ритмов организма. В некоторых работах указывается, что мелатонин обладает противоопухолевым и антистрессовым эффектами [2]. В настоящей работе на фоне проведения базисной терапии у больных с лекарственным гепатитом применялся эпифамин. Эпифамин является пептидным биорегулятором, тропным к эпиталамо-эпифизарной области, относится к классу цитомединов, имеющих способность корригировать содержание мелатонина в организме [7]. Ранее нами было показано, что мелатонин может действовать как фактор коррекции антиоксидантного статуса при экспериментальном токсическом гепатите у крыс [5].
Целью работы явилась оценка уровня продуктов липопероксидации – диеновых коньюгатов, активности аконитатгидратазы и содержания цитрата в сыворотке крови больных с лекарственным гепатитом, возникающем на фоне приема противотуберкулезных препаратов, при проведении стандарной терапии и комбинированного лечения с эпифамином.
Материалы и методы. В клиническое исследование было включено 49 человек с лекарственным гепатитом, развивающемся вследствие комплексного приема 4-5 противотуберкулезных препаратов (изониазид, стрептомицин, рифампицин, пиразинамид, этамбутол, микобутин), находящихся на стационарном лечении в Воронежском областном клиническом противотуберкулезном диспансере им. Н.С. Похвисневой.
Среди них 31 мужчина (63%) и 18 женщин (37%). Возраст больных составлял от 21 до 75 лет: средний возраст – 44,1±6,1 года. Все пациенты были больны инфильтративным туберкулезом легких. Средняя продолжительность заболевания составляла 2,7±0,3 месяца. Диагноз лекарственного гепатита был поставлен на основании клинических признаков заболевания, биохимического исследования крови, данных ультразвукового исследования печени. Из сопутствующих заболеваний регистрировались: гипертоническая болезнь – у 27 больных, хронический гастрит в стадии ремиссии – у 21 больного. Критериями исключения из исследования являлись: вирусные гепатиты, злокачественные новообразования, сахарный диабет, острый инфаркт миокарда, острое нарушение мозгового кровообращения. Больные были разделены на 2 группы. Первая группа пациентов (25 человек) находилась на стандартном лечении гепатопротекторами (карсил, эссенциале). Вторая группа пациентов (24 человека) дополнительно к гепатопротекторам получала эпифамин (ООО «Клиника Института биорегуляции и геронтологии», Санкт-Петербург, Россия; удостоверение качества и безопасности №103, регистрационное удостоверение №004471.Р.643.04.2003, биологически активная добавка) по 1 таблетке (10 мг) 3 раза в день за 10-15 минут до еды в течение 7 дней. Контрольную группу составили 65 практически здоровых лиц в возрасте от 21 до 52 лет с нормальными показателями общего и биохимического анализов крови.
Активность АГ определяли на спектрофотометре Hitachi U-1900 при 235 нм в среде, содержащей 0,05 мМ трис-НСl-буфер (рH 7,8), 4 мМ цитрат. За ферментативную единицу (Е) принимали количество фермента, необходимого для превращения 1 мкмоля субстрата в 1 мин при 25оС. Количество цитрата определяли по методу Нательсона [4]. Общий белок определяли унифицированным методом по биуретовой реакции [3]. Содержание диеновых коньюгатов (ДК) определяли спектрофотометрическим методом при 233 нм [1]. В работе использовали цитрат («Sigma», США); трис, ЭДТА («Reanal», Венгрия), остальные реактивы отечественного производства марки «хч» или «чда».
Статистическая обработка материала включала в себя использование стандартных методов вариационной статистики (расчет средних значений (М), ошибка средних значений (m), t-критерия Стьюдента) и непараметрического теста Вилкоксона с использованием программ “STATISTICA 6.0”. Достоверными считались различия при р≤0,05.
Результаты и обсуждение. Перед лечением в сыворотке крови больных всех групп наблюдалось повышение содержания диеновых коньюгатов, являющихся первичными продуктами пероксидного окисления липидов, в среднем в 1,7 (p<0,05) раза по сравнению с результатами, полученными в контрольной группе. Это свидетельствовало об интенсификации свободнорадикального окисления биосубстратов (рис. 1).
Рис. 1. Содержание диеновых коньюгатов сыворотке крови в норме (1), у больных с лекарственным гепатитом после стандартного лечения (2) и комбинированной терапии с эпифамином (3): 
норма, 
до лечения, 
после лечения.
После проведения стандартного лечения в сыворотке больных 1-й группы происходило уменьшение уровня диеновых коньюгатов в 1,4 раза по сравнению с данными, полученными до лечения, что, очевидно, было связано с положительным влиянием карсила и/или эссенциале на свободнорадикальный гомеостаз. Во 2-й группе пациентов после проведения комбинированной терапии с эпифамином содержание диеновых коньюгатов уменьшалось в 1,5 раза. Это подтверждает, что корригирующее действие эпифамина на секрецию мелатонина, благоприятно влияло на активность АОС организма (рис. 1).
Установлено, что у больных 1-й группы с лекарственным поражением печени активность АГ, выраженная в Е на мл сыворотки, была меньше в среднем в 1,8 (p<0,01) раза по сравнению с нормой. Удельная активность фермента уменьшалась в 2,6 (p<0,01) раза. Изменения активности фермента, вероятно, связаны с тем, что при лекарственном гепатите происходит биотрансформация лекарственных препаратов, применяемых в ходе противотуберкулезной терапии, и стимуляция микросомальных цитохром-Р-450 содержащих систем, что сопровождается образованием активных метаболитов, включая АФК [12]. При окислительном стрессе происходит разрушение железо-серных кластеров АГ и инактивация фермента. Полученные данные согласуются с предположениями, что АГ может выступать в качестве чувствительной мишени действия свободных радикалов [9]. Следует отметить, что снижение активности АГ было выявлено нами также в тканях экспериментальных животных при экспериментальном токсическом гепатите [10]. После лечения путем проведения базисной терапии, включающей прием гепатопротекторов, активность АГ, выраженная в Е на мл сыворотки, повышалась на 10%, удельная активность фермента увеличивалась на 7%, что могло быть связано с положительным воздействием проводимой терапии на метаболизм гепатоцитов. Активность АГ, выраженная в Е на мл сыворотки, во 2-ой группе больных перед лечением была ниже в среднем в 1,8 (p<0,05) раза. Удельная активность фермента падала в 2,7 (p<0,05) раза по сравнению с показателями в контрольной группе. После приема эпифамина на фоне базисной терапии, активность АГ, выраженная как в Е на мл сыворотки крови, так и в виде удельной активности у больных с лекарственным гепатитом увеличивалась в среднем в 1,6 (p<0,05) раза. Очевидно, эпифамин, корригируя содержание и синтез мелатонина, повышал антиоксидантный потенциал организма, что приводило к защите молекулы фермента от действия АФК.
При лекарственном поражении печени содержание цитрата в сыворотке крови больных 1-й группы увеличивалось в 1,8 раза (p<0,05) по сравнению с нормой (рис. 2). Очевидно, это было взаимосвязано с нарушением структуры молекулы АГ под действием АФК. Известно, что увеличение уровня цитрата, способствует повышению антиоксидантного потенциала организма [8]. После проведения стандартной терапии, включающей гепатопротекторы, происходило уменьшение концентрации цитрата в 1,5 раза (p<0,05) по сравнению с результатами до лечения. Очевидно, эссенциале и карсил, снижали степень выраженности оксидативного стресса, что могло отражаться на содержании цитрата.
Рис. 2. Содержание цитрата в сыворотке крови в норме (1), у больных с лекарственным гепатитом после стандартного лечения (2) и комбинированной терапии с эпифамином (3): норма, до лечения, после лечения.
В сыворотке крови 2-й группы больных с лекарственным гепатитом наблюдалось также повышение содержания цитрата по сравнению с контрольными значениями (в среднем в 1,8 раза (p<0,05)). После проведения базисной терапии с эпифамином происходило более значительное понижение концентрации цитрата по сравнению с результатами в 1-й группе больных (в 1,7 раза (p<0,05)). Включение эпифамина в базисную терапию, по-видимому, способствовало улучшению состояния свободнорадикального гомеостаза организма, что отражалось на активности АГ и, как следствие, на содержании цитрата (рис. 2).
Выводы
- При лекарственном поражении печени, развивающимся в результате приема противотуберкулезных препаратов, наблюдалось повышение уровня диеновых коньюгатов в сыворотке крови, что свидетельствовало об интенсификации СО. После комбинированной терапии с эпифамином происходило более существенное снижение содержания продуктов липопероксидации по сравнению со стандартным лечением.
- Включение в базисную терапию эпифамина приводило к изменению активности аконитатгидратазы и концентрации цитрата в сторону нормы, что, вероятно, является следствием коррекции содержания мелатонина и проявления его антиоксидантных свойств.
Работа поддержана грантом Президента РФ для молодых ученых №МК-3133.2011.7