Введение
На сегодняшний день многочисленные научные работы посвящены изучению генетических предикторов риска развития метаболического синдрома и аутоиммунной патологии щитовидной железы. В качестве основных маркеров исследуются такие гены как: PPARG3, кодирующего белок-рецептор, активируемый пролифератором пероксисом типа ɣ3 - однонуклеотидная замена C(-681)G (rs10865710), в гене ADRB2, кодирующем бета-2-адренергический рецептор - мутация Arg 16/Gly (rs 1042713), и однонуклеотидная замена T(-47)C (rs1042711) [1]. Кроме того, для гена GNB3, кодирующего гуанин нуклеотидсвязывающий белок бета-3 - синонимичная замена С825Т (rs5443) [2]. Полиморфные маркеры использовались в нашей работе для изучения ассоциации генов-кандидатов с патологией щитовидной железы и метаболическим синдромом.
Согласно, сделанным выводам полиморфный маркер Arg 16/Gly (rs 1042713) гена ADRB2 имел достоверные различия в частоте аллелей и генотипов между основной группой и группой сравнения. Это говорит об ассоциации полиморфного маркера с сочетанным течением у пациентов заболевания щитовидной железы с метаболическим синдромом.
Цель исследования: изучить полиморфизм генов PPARG3, PPARGC1A, ADRB2, GNB3 при тиреоидной патологии, так и при сочетанном течении с метаболическим синдромом (далее МС).
Материалы и методы
В генетическое исследование включены 90 пациентов в возрасте от 18 лет и старше. Из них женщин 65 человек, мужчин - 25 человек.
Геномную ДНК выделяли из 50 мкл периферической крови с использованием набора «MagMax-96 DNA Multi-Sample Kit» (Applied Biosystems, США) и автоматической станции для выделения ДНК MagMax Express 96 (Applied Biosystems, США), методика с использованием магнитных твердых носителей. Выделение проводили согласно рекомендациям производителя. Определение концентрации ДНК в образцах производили на приборе «NanoDrop» (Thermo Scientific, США). Для контроля продукты амплификации визуализировались электрофорезом в агарозном геле.
Для детекции полиморфизмов генов PPARG3 (rs10865710), ADRB2 (rs1042713), ADRB2 (rs1042711), GNB3 (rs5443) использовали флуоресцентно-меченные олигонуклеотиды по технологии TaqMan. В качестве матрицы использовалось 5-10 нг геномной ДНК. Стандартные олигонуклеотиды и олигонуклеотиды, несущие 6-карбоксифлуоресцеин (FAM), карбокси-x-родамин (ROX) были синтезированы в Национальном центре биотехнологий (Астана). Выявление аллельных вариантов исследуемого гена с использованием ПЦР в режиме «реального времени» проводили с использованием термоциклера Rotor Gene (Qiagen. Германия) в 25 мкл реакционной смеси.
Относительный риск развития заболевания по аллелям и генотипам определялся как отношение шансов (OR). Отношение шансов (OR) рассчитывали по соответствующей формуле. OR=1 рассматривали как отсутствие ассоциации, OR>1 свидетельствовало о наличии предрасположенности (фактор риска), OR<1 - о предохраняющем действии (защитный фактор) генетического маркера (аллеля или генотипа) к развитию патологии. Установление соответствия выборок равновесию Харди Вайнберга проводили с использованием критерий χ2. Для диагностических тестов рассчитывалась чувствительность и специфичность по соответствующим формулам с последующим построением характеристической кривой (ROC-кривая).
Результаты исследований
Полиморфный маркер C(-681)G (rs10865710) гена PPARG3
Продукт этого гена контролирует экспрессию генов, вовлеченных в регуляцию обмена жирных кислот и адипогенез. PPARG3 влияет на метаболизм сердечной мышцы, являясь регулятором энергетического баланса, ассоциирован с повышенным индексом массы тела и распределением жировой ткани в организме, что является факторами риска для развития атеросклероза [3].
Полиморфный маркер С825Т( rs5443) гена GNB3
Ген GNB3 кодирует гуанин нуклеотидсвязывающий белок бета-3, расположен на хромосоме 12p13.31. Полиморфизм С825Т(rs5443) заключается в точечной замене основания цитозина (С) на тимин (Т) в 10-м экзоне гена GNB3 [5]. В результате альтернативного сплайсинга аллеля Т теряется 498-620 нуклеотидов в 9-м экзоне, и это приводит к синтезу укороченного белка. Активность синтезируемого G-белка меняется, что может повлечь за собой нарушения в передаче внутриклеточных сигналов и привести к сужению сосудов, гипертонии, гипертрофии левого желудочка, клеточной пролиферации и другим патологиям [2]. Ассоциирован с генетической предрасположенностью к артериальной гипертензии, гипертрофии левого желудочка, ожирению, инсулинорезистентности, сахарному диабету и его осложнениям.
Полиморфный маркер Arg 16/Gly (rs 1042713) гена ADRB2
Ген ADRB2, кодирующий бета-2-адренергический рецептор расположен на хромосоме 5q32. ADRB2 кодирует бета-2-адренергический рецептор - ионный белковый канал, встроенный в цитоплазматическую мембрану клетки, имеющий высокую степень сродства к адреналину и обеспечивающий повышение или понижение активности иннервируемой ткани или органа [4]. Этот маркер связан с особенностями работы нейронных рецепторов, ассоциирован с предрасположенностью к метаболическому синдрому, ожирению, бронхиальной астме, риску развития артериальной гипертензии у больных сахарным диабетом 2-го типа.
Полиморфный маркер T(-47)C (rs1042711) гена ADRB2
Этот полиморфный маркер представляет собой однонуклеотидную замену и находится в 5′-нетранслируемой (регуляторной) области гена ADRB2.
В нашей работе были проанализированы ассоциации полиморфных маркеров всех трех генов. Проведенный анализ данных генетических маркеров , таких как: C(-681)G (rs10865710) гена PPARG3, С825Т( rs5443) гена GNB3, T(-47)C (rs1042711) гена ADRB2 не выявил достоверных (p<0,05) различий в частотах аллелей и генотипов во всех трех сравниваемых группах (табл. 1-3).
Таблица 1. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера C(-681)G (rs10865710) гена PPARG3 (группа пациентов с МС и группа пациентов с коморбидным течением МС и патологией щитовидной железы (далее ЩЖ), группа пациентов только с патологией ЩЖ)
Таблица 2. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера С825Т( rs5443) гена GNB3(группа пациентов с МС и группа пациентов с коморбидным течением МС и патологией ЩЖ, группа пациентов только с патологией ЩЖ)
Таблица 3. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера T(-47)C (rs1042711) гена ADRB2 (группа пациентов с МС и группа пациентов с коморбидным течением МС и патологией ЩЖ, группа пациентов только с патологией ЩЖ)
Из представленных данных в таблице видно, что величины OR по сравниваемым выборкам говорят об отсутствии статистической значимости связи между наличием полиморфного маркера и развитием метаболического синдрома и\или патологии щитовидной железы, согласно оценке доверительного интервала (95% CI включает 1).
Полиморфный маркер Arg 16/Gly (rs 1042713) гена ADRB2
Ген ADRB2, кодирующий бета-2-адренергический рецептор расположен на хромосоме 5q32. ADRB2 кодирует бета-2-адренергический рецептор - ионный белковый канал, встроенный в цитоплазматическую мембрану клетки, имеющий высокую степень сродства к адреналину и обеспечивающий повышение или понижение активности иннервируемой ткани или органа [4]. Этот маркер связан с особенностями работы нейронных рецепторов, ассоциирован с предрасположенностью к метаболическому синдрому, ожирению, бронхиальной астме, риску развития артериальной гипертензии у больных сахарным диабетом 2-го типа.
Анализ данных показал достоверные различия в частоте аллелей и генотипов между группой пациентов с коморбидным течением МС и патологии ЩЖ, и группой пациентов с МС, без диагностированной патологии ЩЖ (р<0,05). Аллель А (OR=0,36; 95% CI=0,16-0,74) и генотип АА (OR=0,03; 95% CI=0,004-0,25) достоверно чаще встречались в группе с коморбидным течением МС и патологией ЩЖ, чем в группе, имеющей только МС, что говорит об ассоциации полиморфного маркера с сочетанным течением у пациентов заболевания щитовидной железы с метаболическим синдромом.
Также, сравнение частот аллелей и генотипов между группой пациентов с коморбидным течением МС и патологии ЩЖ, и группой пациентов с изолированным поражением ЩЖ, показало наличие достоверных (p<0,05) различий. Аллель А (OR =4,13; 95% CI=1,9-9,17) и генотип АА (OR =69,4; 95% CI=3,9-1240), достоверно чаще встречались в группе пациентов с коморбидным течением МС и патологии ЩЖ, чем в группе пациентов с изолированным поражением ЩЖ, что говорит об ассоциации полиморфного маркера с сочетанным течением у пациентов заболевания щитовидной железы с метаболическим синдромом. Кроме того, генотип AG (OR =0,021; 95% CI=0,001-0,38) ассоциирован с заболеванием щитовидной железы без наличия метаболического синдрома. Таким образом, нами показана ассоциация аллеля А и генотипа АА полиморфного маркера Arg 16/Gly (rs 1042713) гена ADRB2 с сочетанным течением заболевания щитовидной железы с метаболическим синдромом.
Тем более что анализ данных частот аллелей и генотипов по группе пациентов, имеющих только МС и группе пациентов, у которых обнаружено только изолированное поражением ЩЖ не выявил достоверных (p<0,05) различий в частотах аллелей и генотипов между сравниваемыми выборками. Величины OR по сравниваемым выборкам также говорят об отсутствии статистической значимости связи между наличием полиморфного маркера и развитием метаболического синдрома согласно оценке доверительного интервала (95 % CI включает 1) (табл. 4).
Таблица 4. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера Arg 16/Gly (rs 1042713) гена ADRB2, группа пациентов с МС и группа пациентов с коморбидным течением МС и патологией ЩЖ
Выводы
Статистически значимые различия обнаружены в гене ADRB2, а именно в полиморфном маркере Arg 16/Gly (rs 1042713) гена. Корреляция обнаружена между встречаемостью аллеля А (OR=0,36; 95% CI=0,16-0,74) и генотипа АА (OR=0,03; 95% CI=0,004-0,25), которые достоверно чаще встречались в группе с коморбидным течением МС и патологией ЩЖ, чем в группе, имеющей только МС, что говорит об ассоциации полиморфного маркера с сочетанным течением у пациентов заболевания щитовидной железы с метаболическим синдромом.