Значительные изменения в эволюционно сложившемся микробиоценозе человеческого организма на фоне нарастающих экологических проблем и в эпоху антибиотиков, условиях действия других факторов влияющих на иммунный статус макроорганизма широко исследуются микробиологами и клиницистами с целью разработки путей профилактики развития различных патологических состояний. [3,7,14,16] Нормальная флора половых органов имеет важное значение для поддержания здоровья женщины во все периоды её жизни. Нарушения микробного спектра возникают вследствие изменений локального и общего иммунитета, неблагоприятных внешних воздействий, необоснованного применения фармацевтических средств при ряде инфекционных и соматических заболеваний [1,2,12,17].
Нормальная микрофлора влагалища играет важную роль и включает представителей облигатной, факультативной и транзиторной флоры. Облигатная или индигенная флора принимает участие в регулировании оптимального уровня метаболических процессов организма хозяина, создание высокой колонизационной резистентности половых путей женщин. Последняя подразумевает совокупность механизмов, обеспечивающих постоянство количественного и видового состава нормальной микрофлоры, что предотвращает заселение влагалища патогенными микроорганизмами или чрезмерное размножение условно – патогенных микроорганизмов, входящих в состав нормального микроценоза и распространение их за пределы своих экологических ниш [2,10,17,20].
Результаты современных исследований позволяют характеризовать вагинальную микроэкосистему как весьма динамичную и многокомпонентную по своему видовому составу. Строгая эстрогензависимость является её отличительной особенностью и объясняет динамическую изменчивость в разные периоды жизни женщины (пубертатный период, половое созревание, репродуктивный период), а также на протяжении менструального периода в фертильном возрасте при использовании контрацептивов [3,8,13, 20].
На протяжении многих лет женщины использовали контрацептивы. Барьерные методы контрацепции относятся к самым древним. В первой половине 20 века влагалищные барьерные средства считались современными контрацептивами и в течении многих лет были единственными из известных противозачаточных средств. Использование барьерных методов контрацепции позволяет не только предотвратить трансмисивные инфекции, но и снизить риск их последствий. По этому многие текущие программы планирования семьи предусматривают их обязательное применение не только как контрацептивных, но и профилактических средств [1,9,15,19].
Цель работы. С учётом вышеизложенного, мы поставили перед собою цель изучить качественный и количественный состав микрофлоры гениталий женщин, биологические свойства вагинальных лактобактерий в обеспечении их колонизации, адгезию, антагонистические свойства и способность лактобактерий продуцировать перекись водорода, а также показатели местных факторов защиты гениталий таких как лизоцимная активность, показатель фагоцитоза, определение уровня секреторного IgA, у женщин фертильного возраста, использующих контрацептивы в динамическом аспекте т.е. через 1 и 5 лет в условиях Узбекистана [6, 8,9,11].
Материалы и методы. Для решения поставленной цели нами проведены микробиологические и иммунологические исследования выделений из генитального тракта 90 женщин репродуктивного возраста. Которые были разделены на три группы:
- Контрольная группа – 40 здоровых женщин фертильного возраста, не использующих контрацептивы;
- 28 женщин фертильного возраста использующих контрацептивы (спираль) в течение 1 года;
- 22 женщины фертильного возраста использовавшие контрацептивы (спираль) в течение 5 лет;
Первоначально, нами проведены микробиологические исследования по определению количественного и качественного состава выделений из влагалища и цервикального канала. В этих целях забор материала проводили стерильной ложкой Фолькмана, из полученного материала готовили ряд серийных разведений. В последствии из соответствующих разведений производили посев на высокоселективные дифференциально-диагностические питательные среды (табл. 1).
При проведении микробиологических исследований особое внимание уделялось культурам лактобактерий. Учёт результатов посева проводили путём подсчёта количества выросших колоний каждого вида.
Таблица 1. Микробиологические методы исследования
Идентификацию выделенных микроорганизмов до рода и вида проводили на основании морфологических, тинкториальных, культуральных и биологических свойств, в соответствии с определителем микроорганизмов Берги (2001) [15]. Количество микробов каждого вида выражали в lg M±m КОЕ/мл.
Способность микроорганизмов прикрепляться к эпителиальным клеткам генитального тракта, т.е. адгезивный процесс, изучали по методу В.И. Брилиса (1984) [4]. Объектом адгезии служили эритроциты человека 1-ой группы. В качестве тест-микробов были использованы штаммы St. aureus, St. haemoliticus, E.сoli, C.albicans и др. Готовили исходную взвесь тест культур в концентрации 109, а взвесь эритроцитов в концентрации 108. В пробирки объединяли по 0,5 мл взвесей и инкубировали в течениt 30 мин. на встряхивателе при температуре 37оС. После чего готовили мазок и смотрели под световым микроскопом, определяли признак адгезивности микроорганизмов. Существенные различия считали при ≥20% адгезированных микробов.
Активность лизоцима в вагинальном отделяемом определялась нами при помощи способа предложенного Алиевым Ш.Р. (1994) [11], который включал использование стерильных бумажных дисков. Эти диски (схожие с антибиотиковыми дисками) брали пинцетом и тщательно пропитывали их в выделениях из влагалища. Затем их укладывали на поверхность питательного агара (агар Дифко) в чашках Петри, засеянных газоном суточной культурой М. luteus (штамм 003596\126, национальная коллекция микроорганизмов инфекций человека НИИЭМИЗ МЗ РУз), посевы инкубировали в термостате при температуре 37оС, активность лизоцима определяли по методу диффузии в агаре.
Антагонистическую активность лактобацилл в отношении условно патогенных бактерий изучали по методу отсроченного антагонизма[8]. С этой целью 2-x суточную культуру лактобацилл выращенную на среде
МРС-4 засевали совместно с 0,1 мл односуточной тест - культурой. Об антагонистической активности судили по зоне отсутствия роста тест штаммов, выдержанных 24 часа при температуре 37оС.
Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли по методу Темурбаева в модификации А.В. Антонова (1996) [8] . Для этого отобранный материал очищали, промывали забуферным раствором и центрифугировали при 1000об\мин, надосадочную жидкость сливали, а к осадку добавляли 0,5 мл физиологического раствора. К 0,2 мл полученной смеси, в пробирке прибавляли 0,1 мл взвеси частиц латекса диаметром 0,8 мкм. Смесь инкубировали во влажной камере 30 мин при 37оС постоянно встряхивая. В последующем из этой смеси готовили мазки по типу мазка крови, окрашивали по Романовскому-Гимзе. Подсчитывали под микроскопом не менее 100 нейтрофилов с латексом и без него в каждом препарате и определяли показатель уровня фагоцитоза.
Определение секреторного иммуноглобулина класса А (sIgA) основан на методе Manchini (1964) [18], который заключается в измерении диаметра кольца преципитации, образующего при внесении исследуемой сыворотки в лунки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергирована моноспецифическая антисыворотка. В стандартных условиях опыта диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации иммуноглобулина. Содержание иммуноглобулина определяли относительно стандартной сыворотке человека с известной концентрацией иммуноглобулинов.
Результаты исследования и их обсуждение. Микробиологические исследования по изучению количественных и качественных показателей флоры влагалища и цервикального канала у здоровых женщин в норме показали (табл. 2), что в данном биотопе флора довольно разнообразна. Хотя, следует заметить, что микрофлора влагалища несколько превалирует над флорой цервикального канала (табл. 2).
В тоже время по количеству лактобактерий ведущие позиции принадлежат цервикальному каналу. По всей видимости, это эволюционно закрепившаяся способность этого биотопа, направленная на защиту эшелонов генитального тракта. Полученные нами количественные данные у здоровой группы женщин вполне коррелируют с данными имеющихся в литературных источниках.
В тоже время микробиологические исследования по изучению количественных параметров флоры гениталий у женщин использующих контрацептивы (спирали) на ранних этапах, т.е. в течении одного года (табл. 2) показало, что в изучаемых биотопах наблюдаются дисбиотические изменения. Так, как видно из таблицы, общее количество анаэробов в обоих биотопах снизилось почти на одну треть. При этом, наибольшие сдвиги отмечены в количестве лактобактерий, так их количество во влагалище составляло lg 3,81±0,17 КОЕ/мл, а в цервикальном канале lg 3,92±0,18 КОЕ/мл. Хотя следует заметить, что изменения в количестве бифидобактерий в этих биотопах недостоверны.
Однако наиболее выраженные количественные сдвиги у женщин этой же группы нами отмечены в факультативной группе микробов. Так, достоверно выросли в количестве, как во влагалище, так и в цервикальном канале такие показатели как общее количество аэробов, стрептококки группы D, эшерихии, грибы рода Кандида. Нельзя не отметить, появление в этих ареалах микробов, которые не высевались у здоровой группы это штаммы золотистого стафилококка, стрептококка группы А и гарднереллы. Появление этих микробов, которые обладают большим набором ферментов патогенности, несомненно, настораживает и предупреждает о возможном развитии патологических процессов.
Таблица 2. Микроэкология генитального тракта женщин фертильного возраста в норме и использующих конрацептивы (спираль) в течение 1 года (lg M ± m KOE/мл)
Примечание: здесь и далее * Р<0,05 достоверность различий по отношению к норме в исследованной группе; ** Р<0,1 достоверность различий по отношению к норме в исследованной группе.
Представляло интерес изучение этих же количественных показателей микробов в изучаемых экологических нишах у женщин, использующих контрацептивы (спираль) в более отдалённые сроки, т.е. в течение 5 лет. Полученные данные при этих исследованиях представлены в табл. 3. Изменения имеющиеся у женщин, которые использовали контрацептивы течение 1 года, почти полностью сохранились.
Таблица 3. Микроэкология генитального тракта женщин фертильного возраста в норме и использующих конрацептивы (спираль) в течение 5 лет (lg M ± m KOE/мл)
По некоторым показателям нами отмечены позитивные сдвиги, особенно в факультативной группе микробов, это коснулось уменьшении количества эшерихий, грибов и элиминации стрептококков группы А. В анаэробной группе микробов, особенно в количестве лактобактерий, достоверных сдвигов не отмечено.
Основываясь на полученных микробиологических данных, можно с большой уверенностью констатировать, что данное состояние флоры гениталий можно объяснить как развитие в организме комплексаторно-приспособительных процессов на длительное использование контрацептивов.
При проведении микробиологических исследований, одной из главных задач было изучение видовой дифференциации лактобактерий, выделенных из гениталий женщин, использующих контрацептивы в течении 1 года и 5 лет. Эти исследования показали, что в гениталиях этих женщин в основном встречаются 6 видов лактобактерий (табл. 4,5). При этом, среди 6 видов, основную массу составляют 2 вида - L. fermentum (32% и 46% соответственно) и L. acidofilus (21% и 23% соответственно), а самые низкие показатели по встречаемости принадлежат L. сrispatus (по 4% в обеих группах). Интересно отметить, что по данным Российских учёных (Забилова Т.М., 2001 [8]) в гениталиях женщин, использовавших контрацептивы, по сравнению с нашими данными имеются некоторые различия. Так, по их данным основную массу лактобактерий, встречающихся в генитальном тракте женщин фертильного возраста, использующих контрацептивы, в ранние сроки наблюдения (1 год) являются штаммы L. аcidofilus (52%), а в поздние сроки наблюдения (5 лет) - 38%. Самые низкие показатели по этим данным отмечены по штаммам L. сrispatus (12%).
Таблица 4. Виды лактобактерий выделенных из гениталий женщин фертильного возраста в норме и использовании контрацептивов в течение 1 года
Таблица 5. Виды лактобактерий выделенных из гениталий женщин фертильного возраста в норме и использовании контрацептивов в течение 5 лет
Необходимо отметить, что все исследуемые представители вагинальной лактофлоры обладали адгезивными свойствами. В норме этот показатель не превышает 85%, тогда как у женщин использовавших контрацептивы в течение 1 и 5 лет показатель адгезивной способности был равен 78% и 81% соответственно (табл. 6,7).
Изучение антагонистических свойств лактобактерий показало, что наибольший подавляющий рост лактобациллы оказали на стафилококки и эшерихии. Таким образом, антагонистические свойства у лактобактерий, выделенных из гениталий женщин, использовавших контрацептивы в течение 1 года проявились в 86% случаях, а у женщин использовавших контрацептивы в течение 5 лет – в 90% случаев.
Таблица 6. Биологические свойства лактобактерий выделенных из гениталий у женщин фертильного возраста в норме и использовании контрацептивов в течение 1 года
У всех штаммов лактобактерий была изучена способность продуцировать перикись водорода как свойство, важное в реализации колонизационной резистентности.
Перекись водорода, синтезируемая лактобацилами, является не специфическим фактором антимикробной защиты, определяющим нормальное состояние вагинальной экосистемы [1,9, 13]. В проведённых исследованиях (табл. 5) перекись водорода лучше продуцировалась у L.acidophilus (3,32 ммоль/л),L.crispatus (3,29 ммоль/л) и L. rhamnosus (1,84 ммоль/л). Перекись продуцирующие лактобациллы были обнаружены в вагинальном отделяемом 71% женщин, использующих контрацептивы 1 год и у 77% женщин, использующих контрацептивы в течение 5 лет.
Таблица 7. Биологические свойства лактобактерий выделенных из гениталий у женщин фертильного возраста в норме и использовании контрацептивов в течение 5 лет
При изучении лизоцим-продуцирующей способности латобацилл у женщин с нормоценозом была выявлена широкая распространенность данного признака в популяции лактобацилл и значительно меньшая у женщин, использовавших контрацептивы. Было выявлено, что выделения гениталий 98% здоровых женщин обладали лизоцим продуцирующей активностью. Среди женщин фертильного возраста со спиралью в течении 1 года выявлено (табл. 6), что в генитальном тракте женщин титр лизоцима равен 23,7±0,25мкг/мл. А изучение той же лизоцим-продуцирующей активности вагинального отделяемого у женщин использующих спираль в течении 5 лет показало, что титр равен 22,6±0,14 мкг/мл.
Изучение фагоцитарной активности нейтрофилов в выделениях гениталий здоровых женщин показало (табл. 8), что фагоцитарная активность равна 82,5±1,94%, тогда как для женщин, использовавших контрацептивы 1 год, этот показатель равен 76,7%±0,78%, а у женщин, пользующихся контрацептивами 5 лет - 79,4±1,13%. Показатели фагоцитарной активности нейтрофилов в России несколько отличаются от наших данных, у здоровых женщин - 72,5%; а при использовании контрацептивов в течение 5 и более лет - 78,2%.
При изучении уровня секреторного sIgA выявилось (табл. 8), что при использовании контрацептивов в вагинальном тракте женщин sIgA выявляется в достаточно низких, или средних показателях, что составляет около 0,160±0,007 у женщин, пользующихся контрацептивами 1 год и 0,152±0,006 у тех женщин, которые используют контрацептивы в течении 5лет. У здоровых женщин этот показатель немного выше - 0,165±0,002. Данные, полученные от учёных, проводивших исследования в российском регионе показали, что существенных различий не наблюдается: 0,162 у женщин использовавших контрацептивы в течении 1 года, 0,154 у женщин с контрацептивами в течении 5 лет и 0,166 при нормоценозе у женщин фертильного возраста.
Проведя анализ микробиологических и иммунологических исследований материалов, полученных от 50 женщин, использовавших контрацептивы, из них 28 использовали его в течение 1 года и 22 в течение 5 лет, выявлено, что микрофлора влагалища очень разнообразна, но при этом лактофлора всё же является одним из основных компонентов вагинального микробиоценоза, и играет важную роль в поддержании колонизационной резистентности.
Таблица 8. Состояние местных факторов защиты гениталий у женщин фертильного возраста в норме и использовании контрацептивов в течение 1 года и 5 лет
Нарушения микробного спектра возникают вследствие изменений локального иммунитета, и возникает вероятность размножения патогенных и условно–патогенных микроорганизмов, что может привести к вагинальному дисбиозу. Это связано со способностью лактата и других органических кислот продуцировать, перекись водорода, лизоцим, способности к адгезии, антагонизму и др. факторы, что приводит к изменению микроэкологических условий (снижение рН) и как следствие к элиминации или подавлению размножения микроорганизмов, не свойственных данному биотопу.
Следует отметить, что использованные в данной работе Lactobacillus spp., влияющих на жизнеспособность стафилококков и эшерихий, представляет особый интерес, так как демонстрирует способность, наряду с общими свойствами лактобацилл, выявлять их видовые особенности.
Колонизирующий потенциал вагинальных лактобактерий видимо зависит и от видовых характеристик. Поддержание нормальной микрофлоры влагалища играет важную роль в построении локального и общего иммунитета, и сохранении здоровья женщины во все периоды её жизни.
Выводы:
- Микрофлора генитального тракта женщин фертильного возраста очень разнообразна, но при этом лактофлора является одним из основных компонентов вагинального микробиоценоза и играет важную роль в поддержании колонизационной резистентности.
- Колонизация лактобациллами репродуктивного тракта женщин может служить моделью для понимания механизмов формирования микробиоценозов человека и разработки методов рациональной коррекции дисбиотических состояний.
- Нарушения нормальной микрофлоры влагалища могут приводить к различными дисбиотическим состояниям вагинального тракта женщин фертильного возраста, использующих контрацептивы.
- В зависимости от региона, в котором проводятся исследования микрофлоры генитального тракта женщин фертильного возраста, может изменятся не только качественный и количественный состав самой микрофлоры гениталий, а также адгезивная, антагонистическая и лизацимная активность, но и показатели факторов местной защиты.