Эндометриоз – дисгормональное, иммунозависимое, генетически детерминированное заболевание, связанное с доброкачественным разрастанием ткани, морфологически и функционально подобной эндометрию, за пределами слизистой оболочки полости матки [1, 4, 8].
В структуре гинекологической заболеваемости эндометриоз занимает 3-е место после воспалительных процессов и миомы матки, поражая до 50% женщин с сохраненной менструальной функцией. При этом истинную частоту заболевания установить довольно трудно, поскольку, с одной стороны, диагноз можно поставить только интраоперационно, а с другой, у многих женщин оно протекает бессимптомно [4, 9].
Эндометриоз приводит к функциональным и структурным изменениям в репродуктивной системе, стойкому болевому синдрому и бесплодию [1, 9]. По данным отечественных и зарубежных исследователей бесплодие при эндометриозе встречается в 30-60% случаев и является одним из основных симптомов проявления данной патологии [2, 8, 9].
Как свидетельствуют результаты ранее проведенных исследований, раскрывающих основы этиологии, патогенеза и клинических проявлений эндометриоза, разработана концепция лечения этого заболевания, включающая хирургический метод и медикаментозную терапию [1, 3, 8, 9]. Однако, несмотря на полученные достижения, частота наступления беременности у женщин с бесплодием, больных эндометриозом, после проведения курса лечения не превышает 30-33% [2, 3, 9], что требует углубления исследований и поиска новых стратегий, направленных на повышение эффективности лечения.
Не вызывает сомнения тот факт, что в патогенезе генитального эндометриоза важная роль принадлежит нарушениям иммунного гомеостаза, в том числе и генетически обусловленным, предрасполагающим к определенному ответу иммунной системы на формирование эндометриоидных гетеротопий, их инвазию и распространение. В последние годы большое внимание уделяется изучению роли цитокинов в механизмах формирования эндометриоидных очагов [1, 4, 9].
Методами молекулярной медицины было установлено, что гены цитокинов характеризуются наличием одного или нескольких структурных полиморфизмов, которые оказывают влияние на функциональную активность или уровень экспрессии кодируемых белков [5, 6]. В связи с этим представляется актуальным анализ функционального полиморфизма генов иммунорегуляторных цитокинов при эндометриозе в сочетании с бесплодием.
Материал и методы исследования. В исследовании приняли участие 135 пациенток репродуктивного возраста от 19 до 43 лет (средний возраст 30,6±1,2 года), которые были госпитализированы в гинекологическую клинику ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России в 2009-2012 гг. для выполнения лечебно-диагностической и оперативной лапароскопии и гистероскопии. Показанием к оперативному вмешательству явилось бесплодие. Основную группу составили 92 пациентки (68%) с эндометриозом, страдающие бесплодием. Диагноз эндометриоза был поставлен в результате осмотра брюшины и органов малого таза на наличие эндометриоидных очагов в ходе эндоскопических методов исследования, с последующим гистологическим подтверждением. Группа сравнения была сформирована из 43 пациенток (32%) с бесплодием различной этиологии, которым была выполнена диагностическая лапароскопия и исключен генитальный эндометриоз. Лапароскопию и гистероскопию выполняли по стандартной методике с использованием аппаратуры фирмы «Karl Storz» (Германия).
У всех женщин было получено добровольное информированное согласие на забор и использование крови для проведения исследований. Кровь для молекулярно-генетических методов исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях у всех пациенток утром в день операции. Стабилизированные образцы крови хранили при –70°С до момента исследования. Выделение ДНК из периферической крови проводили сорбентным методом согласно инструкции, прилагаемой к коммерческому набору «ДНК-сорб-В» («ИнтерЛабСервис», Россия). Исследование полиморфных участков генов цитокинов проводили с использованием аллель-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР). Были исследованы два полиморфных варианта: T-330G гена IL2 и С-590Т гена, локализованых в промоторных участках генов и отвечающих за уровень экспрессии соответствующих цитокинов. Амплификацию осуществляли согласно инструкции, прилагаемой к коммерческому набору «АмплиСенс-200-1» («ИнтерЛабСервис», Россия), в пробирках типа «Эппендорф» путём ПЦР, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе при использовании амплификатора «Терцик МС2» («ДНК-технология», Россия). После проведения ПЦР 8 мкл амплификата разделяли в 2% агарозном геле, содержащем 0,5 мг/мл этидиум бромида, при напряжении 150 B в течение нескольких мин для последующей визуализации в ультрафиолетовом свете, подтверждающей наличие продукта амплификации. В качестве маркера размера ДНК использовали плазмиду pUC19, расщепленную рестриктазой MspI («Сибэнзим», Россия).
Содержание цитокинов (IL-2 и IL-4) в сыворотке крови и перитонеальной жидкости оценивали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа в соответствии с инструкциями, прилагаемыми производителями тест-систем («Cytimmune», США; «Procon», Россия). Оптическую плотность растворов регистрировали на микропланшетном фотометре Multiskan EX («ThermoLabSystems», Финляндия). Концентрацию цитокинов рассчитывали по калибровочной кривой.
Для проверки нормальности распределения показателей использовали критерий Колмогорова-Смирнова; равенство выборочных средних проверяли по t-критерию Стъюдента (в случае нормального распределения) и U-критерию Манна-Уитни (при отклонении распределения от нормального). Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с эндометриозом сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах женщин, используя критерий χ2 с поправкой Йетса на непрерывность. Об ассоциации разных генотипов и аллелей с заболеванием судили по величине отношения шансов (odds ratio (OR)) с расчетом для него 95% доверительного интервала (CI).
Результаты исследования и их обсуждение. Ассоциация эндометриоза с бесплодием отмечается многими исследователями, изучающими данную проблему. В то же время в обзорах, обобщающих данные о взаимоотношении бесплодия и эндометриоза за последние годы, так и не был дан ответ на вопрос: имеют ли эти состояния четкую причинно-следственную, патогенетически обусловленную связь между собой? Несмотря на важность проблемы и большое количество предположений, однозначного и удовлетворительного объяснения увеличения частоты бесплодия у пациенток с эндометриозом до сих пор не существует [2, 3, 7, 9].
В ходе проведенного нами исследования было установлено, что средняя продолжительность бесплодия у пациенток с эндометриозом составила 3,6±1,1 лет, которое у 61 пациентки (66%) было первичным, а у 31 женщины (34%) оказалось вторичным. Кроме того, 68 женщин (74%) данной группы предъявляли жалобы на болевой синдром, 68 (74%) – на дисменорею, 35 (38%) – на диспареунию, 33 (36%) – на нарушение менструального цикла по типу мено- и метроррагии.
Наиболее часто, в 85% случаев (у 78 пациенток), во время лапароскопии диагностировались малые формы эндометриоза, в то время как эндометриоидные кисты – в 64% (59 пациенток), из них двусторонние в 30% случаев. Частота ретроцервикального эндометриоза не превышала 13% (12 пациенток). У 53 больных (58%) в малом тазу был выявлен спаечный процесс различной степени выраженности. Чаще встречался умеренно выраженный спаечный процесс органов малого таза – I-II cтепень составила 78% (41 пациентка), III степень и IVстепень составили соответственно 18% и 4% случаев.
Соответственно выявленной патологии, пациенткам проводилась лапароскопическая коррекция, направленная в первую очередь на максимальное удаление всех видимых и пальпируемых очагов эндометриоза и восстановление нормальных отношений органов малого таза – термокаутеризация очагов эндометриоза была выполнена 79 пациенткам (86%), разделение спаек – 55 (60%) и цистэктомия – 59 (64%).
В группе сравнения продолжительность бесплодия составила 2,5±1,1 лет. Первичное бесплодие встречалось у 17 женщин (40%), вторичное – у 26 (60%). Основные жалобы, предъявляемые пациентками, распределились следующим образом: на наличие болевого синдрома указывали 9 пациенток (20%), дисменорею – 6 (13,3%), нарушение менструального цикла по типу мено- и метроррагии – 6 (13,3%). Объем оперативного вмешательства для всех пациенток данной группы был одинаков и представлен, как уже указывалось выше, гистероскопией и диагностической лапароскопией.
Бесплодие при эндометриозе обусловлено нарушениями в иммунной системе, которые могут опосредоваться несколькими путями.
Инфертильность может развиваться из-за повышенного фагоцитоза макрофагами сперматозоидов и яйцеклеток, в свою очередь повышенное содержание макрофагов в перитонеальной жидкости обусловлено развитием воспаления, вызванного присутствием самих гетеротопий, а активация фагоцитарной активности обусловлена наличием повышенного содержания ионов железа, попадающих в брюшную полость с ретроградной менструацией, наличием антител к фосфолипидам, эндометрию и сперматозоидам [2, 3, 7, 9].
Еще одна причина бесплодия при эндометриозе – количественные изменения в цитокиновой системе на локальном уровне. В перитонеальной жидкости у женщин с эндометриозом и бесплодием значительно повышен уровень ингибитора миграции макрофагов, что способствует росту гетеротопий. Сами гетеротопии секретируют специфические вещества, стимулирующие макрофагально-макроцитарную систему, в результате чего происходит изменение уровеня интерлейкинов (IL), фактора некроза опухолей, факторов роста [2, 3].
В связи с этим на следующем этапе нашей работы всем обследованным женщинам был проведен анализ функционального полиморфизма генов IL2 и IL4. Выбор цитокинов был не случаен, провоспалительный IL-2 играет ключевую роль иммунном ответе, что связано с его способностью направлять дифференцировку наивных CD4+ T-лимфоцитов в Т-хелперы I типа (Th1) и регулировать интенсивность реакции гиперчувствительности замедленного типа. Противовоспалительный IL-4, являясь продуктом Th2-лимфоцитов, выступает в качестве антагониста Т-активирующих цитокинов, тем самым, способствуя поляризации иммунного ответа в направлении гуморального типа реагирования [6, 8].
В промоторной зоне гена IL2 известен полиморфизм T-330G, который относится к однонуклеотидным полиморфизмам и характеризуется заменой тиминового нуклеотида на гуаниновый [5]. В ходе иммуногенетического исследования было установлено, что у женщин с эндометриозом (44%) и пациенток без данной патологии (47%) чаще встречался гомозиготный по аллелю T генотип полиморфизма T-330G гена IL2. Обращало на себя внимание статистически значимое увеличение частоты генотипа GG полиморфного участка T-330G гена IL2 среди женщин с эндометриозом (χ2 =1,46; р=0,05) относительно аналогичного показателя у женщин без эндометриоза. Кроме того, была показана положительная ассоциация генотипа GG (OR=1,65) и аллеля G (OR=1,30) полиморфного региона T-330G гена IL2 с эндометриозом (табл. 1).
Исходя из того, что исследуемый полиморфизм T-330G гена IL2 расположен в промоторной области, нами была предпринята попытка выяснить характер влияния данного полиморфизма на уровень продукции кодируемого цитокина. Была выявлена значимая ассоциация между сниженным содержанием IL-2 в сыворотке крови (35,9 пг/мл, p=0,008) и перитонеальной жидкости (29,6 пг/мл, p=0,032) и генотипом GG полиморфизма T-330G гена IL2 у пациенток с эндометриозом. Таким образом, показано, что аллельный полиморфизм T-330G гена IL2 оказывает влияние на уровень секреции IL-2. Наличие в генотипе женщины генотипа GG полиморфизма T-330G гена IL2 ведет к гипопродукции соответствующего белка, что способствует функциональному дефекту клеточного звена иммунной системы, что в свою очередь является фактором риска развития эндометриоза и связанного с ним бесплодия.
Таблица 1. Распределение генотипов и аллелей полиморфизма T-330G гена IL2 (%, абс.) среди обследованных женщин
Примечание: здесь и в табл. 2: χ2 – стандартный критерий Пирсона для сравнения частот генотипов и аллелей генов; OR – критерий отношения шансов, отражающий относительный риск развития заболевания при определенном генотипе по сравнению с женщинами без эндометриоза с 95% доверительным интервалом.
Обнаруженное нами повышение уровня IL-4 в сыворотке крови (77,8 пг/мл, p=0,047) и перитонеальной жидкости (102,3 пг/мл, p=0,003) у пациенток с эндометриозом позволило предположить влияние структуры промотора гена IL4 на активность транскрипции и дальнейшего синтеза цитокина. По данным литературы, на роль иммуногенетического маркера претендует аллельный полиморфизм С-590Т гена IL4 [5].
Исследование характера распределения аллелей и генотипов полиморфизма С-590Т промотора гена IL4 показало, что большая часть обследованных женщин являются носителями гомозиготного варианта СС полиморфного участка С-590Т гена IL4. Также было отмечено статистически значимое увеличение количества гомозигот по аллелю Т среди пациенток с эндометриозом (χ2 =8,18; р=0,02) по сравнению с женщинами без данной патологии. Выявлена положительная ассоциация эндометриоза с аллелем Т (OR=2,14), а также с генотипом ТТ (OR=3,79) полиморфизма С-590Т гена IL4. Показано также, что протективным эффектом обладает аллель С (OR=0,47) (табл. 2).
Следует подчеркнуть, что полиморфизм С-590Т гена IL4 также расположен в промоторном регионе и неоспоримым является факт влияния структуры промоторной области на уровень транскрипции гена, судить о котором можно по концентрации кодируемого этим геном продукта. В ходе проведенного исследования было установлено, что наличие в промоторном регионе аллельного варианта -590Т определяет более высокий уровень продукции IL-4 при эндометриозе. Таким образом, присутствие в генотипе женщины аллеля Т и генотипа ТТ полиморфизма С-590Т гена IL4 обусловливает повышенный синтез IL-4, что вызывает поляризацию иммунного ответа и ингибирование Т-клеточной пролиферации, что способствует инвазии эндометриоидных гетеротопий.
Таблица 2. Распределение генотипов и аллелей полиморфизма С-590Т гена IL4 (%, абс.) среди обследованных женщин
Пожалуй, основной функцией иммунной системы организма является поддержание постоянства антигенной структуры, что подразумевает как защиту от чужеродных, так и от генетически измененных своих антигенов, в частности от эндометриоидных гетеротопий [8]. Взаимодействие участников иммунного ответа происходит путем обмена универсальными цитокиновыми сигналами. Нарушения в системе цитокинов необратимо влекут за собой невозможность кооперации и координации иммунной системы, что ведет к пролиферации и инвазии ткани, морфологически и функционально подобной эндометрию, за пределами слизистой оболочки полости матки [4, 8]. Неоспоримым является тот факт, что особенности реагирования организма заложены в нуклеотидной последовательности молекул ДНК, находящихся в ядре клетки. Но нельзя забывать о том, что регуляция генома клетки – процесс очень сложный и в настоящее время недостаточно изученный.
Известно, что гены цитокинов, находящихся в антагонистических отношениях (как IL-2 и IL-4), способны оказывать ингибирующее влияние друг на друга. В связи с этим был проведен анализ распространенности ассоциаций аллельного полиморфизма T-330G гена IL2 и C-590T гена IL4 с эндометриозом. Как показало проведенное исследование, наибольший риск развития бесплодия и эндометриоза оказался ассоциирован с одновременным носительством варианта ТТ полиморфизма T-330G гена IL2 (ответственного за низкую продукцию IL-2) и генотипа GG полиморфизма С-590Т гена IL4 (ассоциированного с высоким уровнем IL-4).