Особенности распределения иммуногистохимического маркера Ki67 в эпителии шейки матки у женщин с хроническим цервицитом

Санкт-Петербургский государственный университет

Введение. Поиски новых методов исследования, облегчающих диагностику неопластических процессов шейки матки, продолжаются до настоящего времени в связи с отсутствием тенденции к снижению заболеваемости раком шейки матки [4]. Одним из высокотехнологичных методов диагностики неопластических процессов шейки матки, дополняющим гистологическое исследование, является иммуногистохимическое исследование белка р16. Этот белок осуществляет контроль безудержной пролиферации клеток. Поэтому при появлении у клетки опухолевого потенциала происходит бесконтрольный синтез белка р16, что проявляется позитивной иммуногистохимической реакцией. Но, несмотря на доказанную взаимосвязь между экспрессией р16 и неопластическими процессами шейки матки [6,8,9,10] до сих пор стоит несколько неразрешённых вопросов. Так в ряде исследований [1,6,7] не было экспрессии р16 у женщин с цервикальной интраэпителиальной неоплазией. Также экспрессия р16 может встречаться в клетках метапластического эпителия шейки матки и в клетках бокаловидного эпителия цервикального канала [5]. Поэтому дополнительный метод исследования, уточняющий информацию о клетке с экспрессией р16, может оказать помощь в установлении правильного диагноза. К таким высокоинформативным иммуногистохимическим маркерам, определяющим пролиферативную активность клеток, относится маркер Ki67, который экспрессируется во всех фазах клеточного цикла, за исключением G0-периода. Поэтому он в полной мере отражает пролиферативный пул клеток.

Цель исследования: изучить особенности распределения иммуногистохимического маркера Ki67 в эпителии шейки матки у женщин с хроническим цервицитом.

Материалы исследования. Проведён анализ данных клинико-лабораторного обследования 100 женщин, из которых 80 женщин составили группу исследования. Все женщины основной группы соответствовали критериям включения в исследовательскую группу: возраст 22-50 лет, отсутствие острых воспалительных процессов гениталий, наличие хронического цервицита, верифицированного данными клинико-лабораторного исследования, наличие аномальной кольпоскопической картины. Группа исследования была разделена на три подгруппы по результатам гистологического исследования тканей шейки матки. В первую подгруппу вошли 23 женщины без плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки (NIL). Вторую подгруппу составили 36 женщин с плоскоклеточными интраэпителиальными поражениями лёгкой степени (LSIL): с кондиломатозом 14 женщин, с цервикальной интраэпителиальной неоплазией лёгкой степени (CINI) 22 женщины. В третью подгруппу вошла 21 женщина с плоскоклеточными интраэпителиальными поражениями тяжёлой степени (HSIL). Из них умеренная цервикальная интраэпителиальная неоплазия (CINII) была диагностирована у 11 женщин, тяжелая цервикальная интраэпителиальная неоплазия (CINIII) у 8 женщин, Сa in situ (плоскоклеточный неинвазивный рак) у 2 женщин.

Контрольную группу составили 20 женщин, отвечающих критериям включения: возраст 22-50 лет; аномальная кольпоскопическая картина. У данной группы женщин кольпоскопическая картина вызывала сомнения, так как при проведении кольпоскопии были обнаружены неспецифические находки (неоднородная поверхность, сосуды, подозрительные на атипичные, хрупкость сосудов). По результатам гистологического исследования биопсии тканей шейки матки патология не подтвердилась.

Из исследования были исключены беременные женщины, женщины с острыми воспалительными процессами любой локализации и женщины с хирургическим лечением шейки матки в анамнезе.

Методы исследования: женщинам обеих групп было проведено обследование: микроскопическое исследование мазков с окраской по Граму, цитологическое исследование эпителия шейки матки на атипию и кольпоскопическое исследование, результаты которого протоколировались согласно действующей международной терминологии Рио-де-Жанейро 2011 года [2]. Диагноз хронического цервицита устанавливался при визуализации гнойных выделений из цервикального канала на протяжении более 2х месяцев в сочетании с воспалительным типом мазка из цервикального канала: >10 лейкоцитов в поле зрения при проведении микроскопии с окраской по Граму [3]. Биопсия эпителия шейки матки проводилась под контролем кольпоскопии по показаниям: аномальная кольпоскопическая картина, получение цитологических мазков типа HSIL, ASC-H (атипичные клетки плоского эпителия, не позволяющие исключить высокую степень плоскоклеточного интраэпителиального поражения), ASC-US (атипичные клетки плоского эпителия неясного значения). Для проведения гистологического исследования ткани шейки матки фиксировали в 10% растворе нейтрального забуференного формалина в течение 24 часов. Далее материал проходил стандартную обработку в спиртах нарастающей концентрации (70-95%), ксилоле и парафине для изготовления гистологических и иммуногистохимических препаратов с толщиной серийных парафиновых срезов 3-5 мкм. Для микроскопического исследования срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Гистологическое исследование биопсийного материала было дополнено определением экспрессии иммуногистохимических маркеров Ki67 и р16 в эпителии шейки матки. Определение экспрессии р16 проводилось с использованием моноклональных мышиных антител клон G175-405 производства фирмы BioGenex; Ki67 с использованием моноклональных мышиных антител клон MIB-1 RTU производства фирмы DakoCytomation по стандартному протоколу. Постановка реакции проводилась непрямым трехступенчатым иммуноферментным LSAB (английский Labeled streptavidin - biotin, DakoCytomation, LSAB 2 System - HRP) методом визуализации. Выявление пероксидазной активности осуществляли с помощью 3,3-диаминобензидина, препараты докрашивали гематоксилином Майера. Оценку экспрессии иммунопозитивных клеток проводили путем подсчета среднего количества клеток в трех полях зрения при увеличении микроскопа Х400 в областях с проявлением окрашивания от слабого до выраженного. Морфологическое исследование гистологических препаратов проводилось при помощи светооптического микроскопа Leica DM LS при увеличении микроскопа Х100 и Х200.

Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с помощью специализированного пакета по статистической обработке данных STATISTICA for Windows с использованием точного критерия Фишера. За критерий статистической достоверности получаемых выводов брали общепринятую в медицине величину р<0,05.

Результаты исследования. Женщинам исследуемой и контрольной групп проводилось цитологическое исследование эпителия шейки матки методом простой онкоцитологии. Результаты исследования представлены в табл. 1.

Таблица 1. Результаты цитологического исследования эпителия шейки матки у женщин с хроническим цервицитом - n (%)

Таблица 1. Результаты цитологического исследования эпителия шейки матки у женщин с хроническим цервицитом - n (%)

Примечание: здесь и далее *- р<0,05 в сравнении с контрольной группой.

В табл. 1 обращает внимание, что у 33,3% (n=7) женщин из подгруппы HSIL были обнаружены цитологические мазки типа LSIL, не соответствующие тяжести поражения (HSIL). Если бы этим женщинам не была проведена кольпоскопия, дополненная прицельной биопсией эпителия шейки матки с последующим гистологическим исследованием, то они могли не получить лечения, соответствующего тяжести плоскоклеточных интраэпителиальных поражений (SIL).

Гистологическое исследование эпителия шейки матки, полученного путем прицельной биопсии во время кольпоскопии, было дополнено определением экспрессии иммуногистохимического маркера р16 с оценкой его распределения в эпителии шейки матки по следующим критериям: отсутствие экспрессии, распределение р16 в пределах 1/3 эпителия, распределение в пределах 2/3 и более эпителия шейки матки. Результаты исследования представлены на рис. 1.

Рис. 1. Распределение р16 у женщин с хроническим цервицитом в зависимости от тяжести интраэпителиальных плоскоклеточных поражений.

Рис. 1. Распределение р16 у женщин с хроническим цервицитом в зависимости от тяжести интраэпителиальных плоскоклеточных поражений.

На рис. 1 наглядно представлено, что у 33,3% (n=12) женщин из подгруппы LSIL не было экспрессии р16, а у 9,5% (n=2) женщин из подгруппы HSIL экспрессия р16 определялась в пределах 1/3 эпителия шейки матки, что не соответствует тяжести интраэпителиальных плоскоклеточных поражений. То есть у 24,6% (n=14) женщин с SIL результат экспрессии р16 можно рассматривать как ложноотрицательный. Тогда как у 8,7% (n=2) женщин из подгруппы NIL с экспрессией р16 в пределах 1/3 эпителиального пласта шейки матки результат исследования можно расценивать как ложноположительный.

Экспрессия иммуногистохимического маркера Ki67 в слоях эпителиального пласта шейки матки также была определена у женщин основной, контрольной групп и по подгруппам. Результаты исследования распределения Ki67 в эпителии шейки матки представлены на рис. 2.

Рис. 2. Распределение иммуногистохимического маркера Ki67 в эпителии шейки матки у женщин с хроническим цервицитом.

Рис. 2. Распределение иммуногистохимического маркера Ki67 в эпителии шейки матки у женщин с хроническим цервицитом.

В контрольной группе (n=20) экспрессия иммуногистохимического маркера Ki67 определялась у 89,5%(n=17) женщин в базальном слое, у 10,5% (n=2)женщин в 1/3 эпителиального пласта шейки матки. В группе исследования экспрессия иммуногистохимического маркера Ki67 определялась в базальном слое у 17,5% (n=14) женщин, в 1/3 эпителиального пласта шейки матки у 32,5% (n=26)женщин, в 2/3 и более эпителиального слоя шейки матки у 50% (n=40) женщин.

Распределение Ki67 в эпителии шейки матки у женщин с хроническим цервицитом в зависимости от тяжести интраэпителиальных плоскоклеточных поражений представлено в табл. 2.

Таблица 2. Распределение иммуногистохимического маркера Ki67 в эпителии шейки матки у женщин с хроническим цервицитом и различной степенью тяжести плоскоклеточных интраэпителиальных поражений (SIL) - показатель (%)

Таблица 2. Распределение иммуногистохимического маркера Ki67 в эпителии шейки матки у женщин с хроническим цервицитом и различной степенью тяжести плоскоклеточных интраэпителиальных поражений (SIL) - показатель (%)

В табл. 2 отражено, что у женщин с хроническим цервицитом происходит увеличение зоны распределения иммуногистохимического маркера Ki67 в эпителии шейки матки в сравнении с группой женщин без хронического цервицита - статистически значимая связь (р<0,05). Так у женщин из контрольной группы экспрессия Ki67 определяется не более, чем в 1/3 эпителия шейки матки. Тогда как у женщин исследуемой группы экспрессия Ki67 в 2/3 и более эпителиального слоя шейки матки определяется у 26,1% женщин из подгруппы NIL, у 44,4% женщин из подгруппы LSIL и у 85,7% женщин из подгруппы HSIL.

Обсуждение результатов. Ни один из проведенных методов исследования эпителия шейки матки (цитологическое, иммуногистохимическое исследование р16 и Ki67) не продемонстрировал полного совпадения с гистологическим диагнозом. Несмотря на это, иммуногистохимическое исследование р16 в эпителии шейки матки у женщин с хроническим цервицитом показало хорошие диагностические возможности в подгруппе HSIL - экспрессия р16 у 90,5% женщин в «2/3 и >» эпителиального слоя. Несколько ниже в подгруппе LSIL- экспрессия р16 у 66,7% женщин в пределах 1/3 эпителия шейки матки. Иммуногистохимический маркер Ki67 также продемонстрировал высокие диагностические возможности в подгруппе HSIL - у 85,7% женщин экспрессия в «2/3 и >» эпителия шейки матки. В подгруппе LSIL распределение Ki67 в 1/3 эпителия шейки матки и в «2/3 и >» эпителия шейки матки сопоставимо: 38,9% и 44,4% соответственно, что, возможно, связано с неоднородностью подгруппы (женщины с койлоцитозом и интраэпителиальной неоплазией шейки матки).

Выводы. Экспрессия иммуногистохимического маркера Ki67 в эпителии шейки матки у женщин с хроническим цервицитом зависит от тяжести интраэпителиальных плоскоклеточных поражений. Распределение Ki67 в эпителии шейки матки устойчиво увеличивается с усилением тяжести интраэпителиальных плоскоклеточных поражений - статистически значимая связь (р<0,05).

Практические рекомендации. Дополнение гистологического исследования тканей шейки матки иммуногистохимическим исследованием маркеров р16 и Ki67 у женщин с хроническим цервицитом и аномальной кольпоскопической картиной позволит снизить процент диагностических ошибок, и как следствие, выбрать правильную тактику ведения пациенток в соответствии с тяжестью патологического процесса шейки матки.

Список использованных источников:

1. Оценка риска злокачественной трансформации эпителия шейки матки при ВПЧ-ассоциированном цервиците/ Л.И. Мальцева, Л.Н. Фаррахова // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2012. - Т.11(4). - С. 43.

2. Новое в кольпоскопии/ С.И. Роговская, Н.М. Подзолкова, Г.Н. Минкина и др.// Гинекология. - 2011. - №6. - C.14-18.

3. Клинические рекомендации по ведению больных с инфекциями, передаваемыми половым путём/ Е.В. Соколовский, Д.А. Лиознов, И.А. Корнеев; под ред. Э.К. Айламазяна.- М., 2014. -119 с.

4. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2013 г. - https://goo.gl/4ppRv4.

5. Шипулина О.Ю. Коэкспрессия онкобелков p16/Ki67 как маркер тяжелой дисплазии шейки матки. 

6. A Prospective Study Showing Long-Term Infection with Human Papillomavirus 16 before the Development of Cervical Carcinoma in situ/ N. Ylitalo, A. Josefsson, M. Melbye et al.// Cancer Research. - 2000. -Vol.60. - P.6027-6032.

7. Evaluation of HPV-16 and HPV-18 genotyping for the triage of women with high-risk HPV+cytology-negativresults/ T.C. Wright, M.H. Stoler, A. Sharma et al. // Am J Clin Pathol. - 2011.-Vol.136.-578-586.

8. Is p16(lNK4A) expression more useful than human papillomavirus test to determine the outcome of atypical squamous cells of undetermined significance-categorized Pap smear? A comparative analysis using abnormal cervical smears with follow-up biopsies/ S. Nieh, S.F. Chen, T.Y. Chu et al. // Gynecol Oncol. - 2005. -Vol.99(3).- P. 578-584.

9. Procedure for immunocytochemical detection of p16lNK4A antigen in thin-layer, liquid-based specimens/ M. Bibbo, W.J. Klump, J. DeCecco et al.// Acta Cytol. - 2002. - Vol. 46.- P. 25-29.

10. Transcriptional regulation of the human papillomavirus-16 E6-E7 promoter by a keratinocyte-dependent enhancer, and by viral E2 trans-activator and repressor gene products: implications for cervical carcinogenesis/T.P. Cripe, T.H. Haugen, J.P. Turk et al.// EMBO J. - 1987.- Vol. 6 (12).- P. 3745 53.