Иммунная тромбоцитопения (ИТП) является одним из наиболее распространенных аутоиммунных заболеваний системы крови, характеризующимся изолированной тромбоцитопенией преимущественно за счет повышенного разрушения тромбоцитов [7, 8, 12]. В основе развития патологического процесса лежат сложные иммунные механизмы, конечным этапом которых является образование антитромбоцитарных антител, приводящих к снижению количества тромбоцитов в периферической крови [14, 16].
В последнее время в литературных источниках начали появляться сообщения о Т-клеточных механизмах деструкции кровяных пластинок [10]. В частности, имеются работы, указывающие на активацию CD8+ T-клеток в лимфоидном органе и их участие в разрушении тромбоцитов у пациентов с ИТП, не отвечающих на иммуносупрессивную терапию [9, 13, 17]. Однако изменения, возникающие в лимфоидном органе при ИТП, до сих пор недостаточно изучены. Известно, что распознавание антигенов, антигензависимая пролиферация и дифференцировка Т- и В-лимфоцитов, образование цитокинов и специфических антител, а также процессы разрушения сенсибилизированных иммуноглобулинами тромбоцитов макрофагами путем опосредованного Fc-рецепторами фагоцитоза происходят в селезенке [1, 2, 5].
Наиболее патогенетически значимыми регуляторными клетками, осуществляющими контроль иммунного ответа и участие в аутоиммунных реакциях, считаются Т-лимфоциты [10, 11]. Тем не менее, работ, касающихся исследований особенностей их распределения, а также количественного состава субпопуляций в лимфоидном органе, недостаточно.
В качестве первой линии терапии больных ИТП применяется консервативная тактика с использованием глюкокортикоидов и внутривенного введения поливалентных иммуноглобулинов. Положительный ответ на это лечение в большинстве случаев удается получить. Однако примерно у 20% пациентов уровень тромбоцитов не повышается, и более чем у половины развивается рецидив. В случаях, когда начальное лечение или терапия рецидива оказались неэффективными, переходят к терапии второй линии, включающей спленэктомию [3, 14]. Эффективность оперативного вмешательства составляет около 66%. Рецидивы заболевания наблюдаются преимущественно в первый год после операции [4, 6]. Рефрактерная форма включает больных с отсутствием ответа на спленэктомию или с рецидивом после нее [15, 18].
Причины возникновения резистентных к иммунодепрессивному лечению форм заболевания до сих пор неизвестны. Более того, открытым остается вопрос изучения особенностей гистологической структуры селезенки при ИТП в зависимости от ответа на операцию. Актуальным остается и поиск как морфологических подтверждений влияния лимфоидного органа на деструкцию тромбоцитов, так и дополнительных патоморфологических критериев прогноза болезни. Это указывает на значимость исследования и целесообразность выявления изменений, возникающих в селезенке при данном патологическом процессе.
В целом, оценка архитектоники селезенки с помощью современных методов, таких как иммуногистохимия и компьютерная морфометрия, весьма целесообразна. Не исключено, что выявленные гистологические изменения органа при разных формах ИТП могут быть использованы как дополнительные критерии прогноза при мониторинге течения болезни после спленэктомии, что имеет большое практическое значение
Цель работы: изучение содержания Т- и В-лимфоидных популяций в селезенке у больных ИТП в зависимости от ответа на лечение.
Объектом исследования явились образцы селезенок 49 пациентов с ИТП (парафиновые блоки). Группу 1 составили обследуемые, у которых после спленэктомии установилась ремиссия (n = 31), в группу 2 были включены пациенты с рефрактерным течением заболевания (n = 18). Возраст обследованных на момент постановки диагноза варьировал от 18 до 66 лет (медиана 37,5 лет). Большую часть больных составили лица женского пола (32 женщины и 17 мужчин). До спленэктомии все больные ИТП, находившиеся на лечении в гематологической клинике Кировского НИИ гематологии и переливания крови, принимали глюкокортикостероиды в дозе 1мг/кг массы тела. Сравнительный анализ проводили с образцами селезенок (судебно-медицинские вскрытия), взятых от 20 лиц, скончавшихся скоропостижно и не имевших в анамнезе заболеваний системы крови. Медиана возраста умерших составила 55 (27-65) лет. Мужчин было 12, женщин - 8.
В процессе работы проводились клинические, статистические, морфометрические, гистологические исследования послеоперационных селезенок (окраска гематоксилином и эозином общепринятым способом). Для оценки клеточного состава селезенок на срезах с парафиновых блоков были выполнены иммуногистохимические реакции с антителами CD3, CD4, CD8, CD20, Т-bet с помощью иммунопероксидазного метода. Оценка гистологических срезов осуществлялась путем подсчета относительного содержания Т- и В-лимфоидных популяций в 20 полях зрения для каждого образца. Впоследствии, с целью определения абсолютного количества данных клеточных элементов и их субпопуляций в селезенке были вычислены значения их масс.
С целью статистической обработки применялась программа SPSS for Windows Version 19.0. Для выявления достоверности различий между показателями в сравниваемых группах использовали непараметрические двусторонние критерии Краскела-Уоллеса, Манна-Уитни с учетом поправки Бонферони при множественных сравнениях. Различия считали статистически значимыми при уровне р<0,05. Результаты исследований представлены с указанием медианы, а также нижнего (25%) и верхнего (75%) квартилей для каждой группы. При оценке качественных признаков использовали метод χ2 с поправкой Иетса. В случаях малого числа наблюдений анализ проводился с помощью точного двухстороннего критерия Фишера.
При морфологическом изучении особенностей распределения Т-лимфоидных элементов в селезенке было установлено, что общая популяция CD3+ клеток определялась как в периартериальных лимфоидных муфтах (ПАЛМ), ближе к центру, окружая сосуд в виде ободка (Т-клеточная зона), так и в красной пульпе органа. В меньшем количестве эти клетки локализовались в герминативных центрах и маргинальной зоне. По абсолютному содержанию CD3+ элементов выявлено увеличение их количества у всех больных ИТП по отношению к группе сравнения вне зависимости от ответа на спленэктомию, р<0,05 (табл. 1). При этом статистически значимое повышение уровня данной клеточной популяции было установлено преимущественно в красной пульпе селезенки. Достоверных различий по массе CD3+ Т-лимфоцитов в белой пульпе органа (в ПАЛМ) по отношению к норме получено не было.
Таблица 1. Содержание CD3+ лимфоцитов в селезенке при ИТП
Примечание: здесь и далее * - достоверность различий по отношению к группе сравнения; ** - достоверность различий между группами больных.
Дальнейшее исследование было направлено на более детальный анализ Т-клеточных субпопуляций. Так, при морфологическом изучении абсолютного содержания CD4+ лимфоидных элементов выявлено увеличение их количества у всех больных ИТП по отношению к группе сравнения вне зависимости от ответа на спленэктомию, р<0,05 (табл. 2). При этом, статистически значимое повышение уровня данной клеточной субпопуляции было установлено преимущественно как в белой (в ПАЛМ), так и красной пульпе селезенки. Кроме того, выявлено, что наибольшее количество CD4+ Т-лимфоцитов было найдено в 1 группе по отношению к пациентам с рефрактерным течением заболевания (р<0,05).
Таблица 2. Содержание CD4+ лимфоцитов в селезенке при ИТП
При исследовании содержания CD8+ Т-лимфоцитов в селезенке было отмечено, что они располагались преимущественно в красной пульпе. В результате морфометрического анализа данной клеточной популяции в лимфоидном органе установлено достоверное увеличение их количества у больных ИТП по отношению к группе сравнения, р<0,05 (табл. 3). При этом повышение массы CD8+ клеток выявлено как в белой, так и в красной пульпе органа, p<0,05.
Статистически значимое увеличение уровня CD8+ лимфоцитов в селезенке у больных ИТП в зависимости от ответа на лечение было определено как в первой, так и во второй группе по сравнению с нормой, р<0,05. При этом большее количество данной клеточной популяции было отмечено в красной пульпе органа. Наиболее высокое содержание CD8+ Т-клеток было выявлено у пациентов с рефрактерным течением заболевания по отношению к обследованным, ответившим на спленэктомию, р<0,05. Данные отличия определены как в белой, так и в красной пульпе лимфоидного органа соответственно, р<0,05.
Таблица 3. Содержание CD8+ лимфоцитов в селезенке при ИТП
Таким образом, в результате исследований гистологических срезов селезенки выявлены особенности распределения и изменения содержания Т-лимфоцитов у больных ИТП в зависимости от ответа на спленэктомию и фазы болезни. Полученные данные свидетельствуют об участии лимфоидного органа в иммунных процессах, происходящих при ИТП, и могут быть использованы в гематологических отделениях в качестве дополнительных критериев, предопределяющих прогноз течения ИТП у больных после спленэктомии, а также дифференцированного подхода при назначении терапии.
При анализе T-bet+-транскрипционного регулятора, являющегося ключевым в Th1 поляризации, установлено статистически значимое увеличение исследуемых клеточных элементов по отношению к норме (р < 0,05). Однако убедительных данных, отражающих изменения данной популяции лимфоцитов от ответа на спленэктомию, получено не было.
В результате исследования В-лимфоцитов (CD20+) на гистологических срезах селезенки у больных ИТП было установлено, что для всех пациентов характерно увеличение абсолютного количества В-лимфоидных элементов по отношению к норме (табл. 4). При этом различия были выявлены как в белой, так и в красной пульпе органа (р<0,05). Различий по содержанию в селезенке CD20+-экспрессирующих клеток у лиц с рефрактерным течением заболевания после спленэктомии и больных, ответивших на операцию, выявлено не было (р>0,05). Полученные результаты свидетельствуют об участии В-лимфоцитов в патогенезе заболевания при всех формах иммунной тромбоцитопении, вне зависимости от ответа на спленэктомию и фазы течения патологического процесса.
Таблица 4. Содержание CD20+ лимфоцитов в селезенке при ИТП
Таким образом, в результате проведенных исследований получены новые данные о структурных особенностях селезенки у больных ИТП, рефрактерных к проводимому лечению. Достоверность результатов была обеспечена использованием современных средств и методов проведения исследования. Так, с помощью иммуногистохимических реакций впервые были выявлены статистически значимые различия содержания клеточных элементов в селезенке по сравнению с нормой, отражающие степень активности иммунных процессов, происходящих в данном органе. Установлены характерные особенности гистоархитектоники селезенки у лиц с ИТП по отношению к группе сравнения. Проведено изучение распределения Т- и В-клеток в функциональных зонах органа (белой и красной пульпы). При морфометрическом исследовании иммуногистохимических особенностей популяционного состава селезенки у больных ИТП была представлена характеристика абсолютного содержания различных субпопуляций лимфоидных элементов. Результаты работы могут быть использованы в гематологических отделениях в качестве дополнительных критериев прогнозирования течения данного патологического процесса после спленэктомии и дифференцированного подхода при назначении терапии.