Заболевания сердечно-сосудистой системы являются ведущими в структуре летальных исходов в промышленно-развитых странах. Ключевое место среди них занимает ишемическая болезнь сердца (ИБС). Во всем мире ведутся работы по изучению этиопатогенетических основ этого заболевания [3].
Смертность от последствий атеросклероза уже к 2020 году может достигнуть 60% всей смертности, несмотря на широкое применение гиполипидемических препаратов. Следовательно, необходима реорганизация профилактики ИБС на популяционном уровне, особенно среди молодых, клинически здоровых лиц [1, 3].
Являясь мультифакториальным заболеванием, ишемическая болезнь сердца, связана с генетическими факторами и факторами окружающей среды. Одной из основных причин развития атеросклероза считается воспаление, как важнейший компонент атерогенеза [5]. Воспаление является неспецифическим проявлением воздействия разнообразными повреждающими факторами на эндотелий сосудов. Во многих исследованиях показана взаимосвязь между повышением уровня провоспалительных цитокинов: ФНО-α, IL-1β, IL-6 с проявлениями дестабилизации атеросклероза и ИБС [1, 2, 5]. В качестве этиологического фактора, способствующего активации хронического воспаления в атеросклеротической бляшке, с вовлечением цитокиновой системы, может являться любая острая инфекционная патология, протекающая с активным воспалительным процессом.
Таким образом, представляет интерес изучение течения стабильной стенокардии и состояния липидтранспортной системы при присоединении сопутствующей инфекционной патологии, с внедрением инфекционного агента и индуцирование имеющегося воспалительного процесса.
Существует немало работ, в которых показана взаимосвязь клинического и лабораторного статуса больных ИБС, перенесших острую респираторную вирусную инфекцию (ОРВИ) и грипп [2, 3, 4]. Ряд вирусов, имеют свойства белков цитокинов, поэтому могут расцениваться как цитокины [7]. Синтез этих белков изменяет эффект цитокинов [3, 7]. При ОРВИ развивается дисбаланс взаимодействия цитокинов на фоне хронической инфекции (герпетической, цитомегаловирусной) [1]. Эти изменения могут приобретать необратимый характер и стимулировать воспалительный процесс [1, 4], мотивировать изменения фармакологической коррекции гиперлипидемии (ГЛП) с учетом наличия отягощающего фона (сопутствующей вирусной инфекции) с поиском наиболее эффективных препаратов с минимальными затратами. Для этого небходимо индивидуализировать подход к лечению больных с проведением генетических исследований для определения комплексной терапии еще до ее начала, с возможностью прогноза эффективности, выражающейся в достижении целевого холестерина (ХС) липопротеидов низкой плотности (ЛНП). В настоящем исследовании на основе данных о прогрессирующем влиянии вирусных инфекций на атеросклероз, оценивали взаимосвязь генетического полиморфизма генов цитокинов с течением ишемической болезни сердца.
Цель исследования - оценить взаимосвязь полиморфизма генов цитокинов у больных ИБС в сочетании с ОРВИ с эффективностью фармакологической коррекции гиперлипидемии розувастатином для обоснования персонализированного подхода к фармакотерапии ГЛП.
Материалы и методы исследования.
Всего было обследовано 120 больных ИБС (56 мужчин и 64 женщины), перенесших ОРВИ, находившихся на госпитализации в ОБУЗ «Областная клиническая инфекционная больница имени Н.А. Семашко». В исследование были включены: женщины постменопаузального периода и мужчины со стенокардией напряжения I-II ФК (пациенты очень высокого риска развития сердечно-сосудистых осложнений с уровнем ХС от 4,0 до 6,5 ммоль/л, ХС ЛНП от 1,8 до 4,0 ммоль/л) и сопутствующей респираторной вирусной инфекцией. Для фармакологической коррекции ГЛП при отсутствии противопоказаний к терапии ингибиторами ГМГ-КоА-редуктазы использовался розувастатин в стартовой дозе 10 мг/сут. Критерии исключения из исследования: отказ пациента от проводимого лечения, наличие сопутствующей патологии, фармакологическая коррекция которой способна повлиять на липидный профиль, индивидуальная непереносимость исследуемых препаратов и побочные эффекты от проводимой терапии [2, 3].
Кровь для исследования брали из локтевой вены утром натощак, не ранее чем через 12-14 часов после последнего приема пищи [2, 3]. Определение ХС, холестерина липопротеидов высокой плотности (ХС ЛВП) и ХС ЛНП проводили ферментативным колориметрическим методом на автоматическом биохимическом анализаторе «Виталаб Флексор Е» (Нидерланды) наборами «Analyticon» (Германия) [1, 2].
Концентрацию интерлейкинов в сыворотке крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью анализатора «Текан» (Австрия) наборами фирмы ЗАО «Вектор Бест» (Россия) в следующие сроки наблюдения: 1, 3, 7 сутки от момента верификации диагноза ОРВИ [2].
Выделение геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) осуществлялось из венозной крови стандартным двухэтапным методом фенольно-хлороформной экстракции [2]. Генотипирование полиморфизмов провоспалительных цитокинов: IL-1β -511C>T (rs16944) и IL-6 -174G>C (rs1800795) проведено полимеразно-цепной реакцией (ПЦР) в режиме реального времени с использованием TaqMan зондов для дискриминации аллелей на амплификаторе CFX96 Bio-Rad Laboratories (США) с использованием коммерческих наборов реактивов TaqMan SNP Genotyping Assays фирмы Applied Biosystems (США) [2, 3]. Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием пакета программ: Statistica 6,0 (StatSoft), MS Excel (Microsoft) [6].
Для оценки соответствия распределения генотипов исследуемых полиморфизмов ожидаемым значениям при равновесии Харди-Вайнберга и для сравнения распределения генотипов и частот аллелей в выборках больных и здоровых лиц использовали критерий χ2. Анализ ассоциации аллелей и генотипов генов IL-1β и IL-6 с риском развития ИБС проводился путем вычисления отношения шансов (OR) и 95%-х доверительных интервалов (95%CI) [1, 3, 5].
Результаты и обсуждение. На амбулаторном этапе наблюдения у больных определялся цитокиновый профиль в рамках мониторирования протекции хронического воспаления при приеме гиполипидемической терапии. На рис. 1 представлен исходный цитокиновый статус больных ИБС.
При анализе цитокинового профиля провоспалительных цитокинов у больных на этапе отбора был зафиксирован активный воспалительный процесс, что проявилось в повышенном уровне IL-1β и IL-6 у больных по сравнению с нормальными показателями [4, 5], что связано с имеющимся хроническим воспалением в атеросклеротической бляшке у больных ишемической болезнью сердца.
Рис. 1. Характеристика фона цитокинов у больных ИБС (N-120) на амбулаторном этапе наблюдения (до заболевания ОРВИ).
Уровень цитокинов в сыворотке крови отслеживался у больных и после госпитализации в инфекционный стационар (в момент заболевания вирусной инфекцией) и далее на всех последующих визитах при динамическом наблюдении. Достоверных различий у больных по гендерным, возрастным особенностям не выявлено. Динамика цитокинового зеркала у больных, перенесших ОРВИ, представлена на 1, 3, 7, 14 сутки в табл. 1.
Таблица 1. Характеристика фона цитокинов у больных ИБС с ОРВИ (N-120) (М±m)
Примечание: здесь и далее * р<0,05 - достоверность изменений показателей в сравнении с исходными данными.
У больных наблюдалось повышение провоспалительных (IL-1β и IL-6) цитокинов в остром периоде инфекционного процесса (р<0,05). При динамическом наблюдении за цитокиновым статусом больных, переносящих вирусную инфекцию, отмеченное повышение противовоспалительных цитокинов служит предиктором активации хронического воспаления, выражавшемся в дестабилизации течения атеросклероза [4, 7]. Так, наблюдалось снижение провоспалительных цитокинов при угнетении процессов воспаления, связанных с выздоровлением больных от ОРВИ. В периоде реконвалесценции (после 7 дня болезни) было выявлено значительное снижение провоспалительного фона, имеющее статистическую значимость (р<0,05) [3].
Изучение цитокинового профиля пациентов с оценкой влияния на активность воспалительного процесса в аспекте дестабилизации течения атеросклероза, продемонстрировало неоднозначность динамики цитокинового профиля, что мотивировало изучение генетических маркеров, ответственных за носительство аллелей, вовлеченных в синтез цитокинов.
Генетическое тестирование больных показало варианты генотипов провоспалительных цитокинов, что представлено в табл. 2.
Таблица 2. Распределение частот полиморфных вариантов генов IL-1β, IL-6 у больных ИБС с ОРВИ
Примечания: 1 - абсолютное число и процент индивидов с соответствующим генотипом; 2 - уровень значимости p для критерия χ2 (df=1).
Среди исследуемых пациентов частота генотипов -511CC, -511CТ, -511ТТ по полиморфизму -511C>T IL-1β соответствовала 41%, 46% и 13%; для генотипов -174GG, -174GC, -174CC по полиморфизму -174G>C IL-6 - 22%, 44%, 34%.
В результате изучения частот генотипов по исследуемым полиморфизмам оказалось, что процентное соотношение генотипов в изучаемых группах не отличалось (р>0,05). У больных незначительно преобладает гетерозиготный генотип -511CT гена IL-1β и -174GC гена IL-6.
Однако стратифицированный по полу анализ позволил выявить ассоциацию гомозиготного генотипа GG гена IL-6 (OR=0,46 95% CI 0,23-0,90 p=0,02) с ухудшением течения ИБС у мужчин с ОРВИ.
Представлялось интересным оценить влияние полученных генотипов провоспалительных цитокинов (IL-1β и IL-6) на показатели интерлейкинов в сыворотке крови и липидный статус больных, в аспекте активации течения хронического воспаления с дестабилизацией липидного профиля [2, 8].
В табл. 3 показана динамика IL-1β при различных генотипах -511C>T.
Таблица 3. Цитокиновый профиль больных ИБС с различными генотипами IL-1β -511C>T (N-120)
При анализе взаимосвязи генетического полиморфизма IL-1β с синтезом интерлейкина-1β выявлена связь генотипа -511CT с повышенной продукцией интерлейкина. Известно, что носительство данного генотипа в промоторе гена IL-1β сопряжено с избыточной продукцией цитокина [7]. При анализе динамических изменений уровня IL-1β получено его снижение на всех точках наблюдения, что связано с угнетением процесса воспаления. Рис. 2 характеризует взаимосвязь генотипов на уровень ХС и ХС ЛНП у больных в момент верификации ОРВИ.
Установлено влияние полиморфизма -511С>Т гена IL-1β на уровень ХС ЛВП у больных ИБС. Так, у носителей гетерозиготного генотипа -511СТ отмечены наиболее низкие значения ЛВП. Причем, эта негативная тенденция проявлялась во всех последующих точках измерения липидных показателей у больных. Известно, что носительство генотипа -511СТ в промоторе гена IL-1β сопряжено с избыточной продукцией цитокина [3, 8]. Следовательно, провоспалительный эффект генотипа -511СТ сопряжен со снижением концентрации ЛВП у больных с ИБС, страдающих ОРЗ.
Рис. 2. Влияние генотипов IL-1β -511C>T на липидный профиль больных p*- ОХ-0,41, ЛВП-0,03, ЛНП-0,99.
При исследовании влияния концентрации IL-1 на содержание в сыворотке крови липидных фракций отмечалась слабая обратная взаимосвязь (r=-0,188, p<0,05) между уровнем ХС и IL-1.
Также было оценено влияние генетического полифиморфизма провоспалительного IL-6 на количественный уровень липидов и самого цитокина.
Таблица 4. Цитокиновый профиль больных ИБС с различными генотипами IL-6 -174GC (N-120)
Из литературы известно, что G-аллель гена IL-6 связана с более высокой продукцией интерлейкина, чем С-аллель. Установлено, что уровень IL-6 в 2 раза выше у гомозигот с G-аллелем, чем у гомозигот с С-аллелем [8].
Согласно литературным данным, IL-6 регулирует ответ острой фазы воспаления [4, 5, 7]. Так, в данном исследовании у носителей -174GG продукция IL-6 была выше по сравнению с другими генотипами (р>0,05), что согласуется с данными других исследований [1, 2, 8].
Рис. 3 характеризует влияние генотипов -174GC на липидный профиль исследуемых больных ИБС с ОРВИ. У носителей генотипа -174GG уровень ХС ЛНП превышает таковой в сравнении с другими генотипами IL-6, выявлена прямая сильная положительная корреляционная связь с уровнем ХС ЛНП (r=0,188, р>0,05), что свидетельствует о дестабилизации липидтранспортной системы в условиях острого воспаления и недостаточной выраженности липидных и нелипидных эффектов статинов, что проявилось в недостижении целевого ХС ЛНП при фармакологической коррекции гиперлипидемии розувастатином 10 мг/сут. [2, 4, 7, 8].
Рис. 3. Уровень цитокинов и показатели липидного обмена у пациентов с различными генотипами -174GC гена IL-6; p*-ОХ-0,81, ЛВП-0,58, ЛНП-0,84.
При фармакологической коррекции ГЛП розувастатином критерием проявления гиполипидемического эффекта стало достижение целевого ХС ЛНП у 77 % больных.
Изучив зависимость продукции интерлейкинов с генотипами, было проведено сравнение влияния генотипов IL-1β -511C>T и -174GG IL-6 на липидный обмен и соответствующий дозовый режим фармакологической коррекции ГЛП. При недостижении больными целевого ХС ЛНП (согласно дизайну исследования) проводилась титрация дозы розувастатина от 10 мг/сут. до 20 мг/сут.
Проанализировав и сопоставив достижение целевого ХС ЛНП при определенной дозе розувастатина с генетической принадлежностью по изучаемым полиморфизмам провоспалительных цитокинов, сделано заключение о возможной ассоциации генотипов провоспалительных цитокинов с ответом на гиполидемическую терапию розувастатином, проявляющуюся в достижении целевого ХС ЛНП.
Так, для больных носителей генотипов -174GG по полиморфизму -174G>C гена IL-6 и -511CT по полиморфизму -511C>T гена IL-1β эффективной дозой розувастатина, способствующей достижению целевого ХС ЛНП, стала доза - 20 мг/сут, что соответствует 42% больных.
Это может быть использовано при обследовании и персонализированном лечении больных ИБС в условиях сопутствующей вирусной инфекции.
Интерлейкин-1β, как один их наиболее активных провоспалительных цитокинов, способен модулировать цитотоксические свойства иммунокомпетентных клеток и, тем самым, усиливать воспалительный процесс, явления альтерации, деструкции и апоптоза [3, 6]. По всей видимости, процессы биосинтеза ЛВП и выработки провоспалительного интерлейкина-1 у больных ИБС сопряжены и могут контролироваться влияниями ни сколько самих генов цитокинов, сколько генами, вовлеченными в молекулярные механизмы атеросклероза, плейотропные эффекты которых реализуются в поддержании воспалительного процесса в стенке артерий и снижении синтеза антиатерогенной фракции ХС ЛВП [2, 7].
Выводы
1) носительство гетерозиготного генотипа -511CT гена IL-1β ассоциируется (0,78 ммоль/л) с пониженным уровнем ХС ЛВП у всех групп исследуемых больных с кардиологической патологией, т.к. определяет большую предрасположенность к нарушению липидного обмена за счет более высоких атерогенных фракций липид-транспортной системы и меньшую эффективность розувастатина 10 мг/сут, по сравнению с другими генотипами
2) носительство генотипа -174GG гена IL-6 коррелировало с повышением синтеза интерлейкина и ХС ЛНП
3) титрация дозы розувастатина (в сторону увеличения) способствует достижению целевого уровня ХС ЛНП у больных ИБС носителей гомозиготного генотипа -174GG гена IL-6 и гетерозиготного генотипа -511CT гена IL-1β.