Введение. В патологии верхних дыхательных путей в течение длительного периода времени сохраняют лидерство заболевания носа и околоносовых пазух. В структуре заболеваний ЛОР-органов синусит составляет от 15 до 36% и является одной из десяти наиболее распространенных нозологических форм амбулаторной практики [2, 5].
Околоносовые пазухи в норме стерильны. Ведущими возбудителями синусита являются Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae. Moraxella catarrhalis, занимая третье место, является более редким возбудителем синуситов у детей. В отдельных случаях причиной синуситов могут быть Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus spp., анаэробы, а также грамотрицательные неферментирующие бактерии и представители семейства Enterobacteriaceae [2, 3, 7, 8].
В последние годы отмечен рост синуситов, вызванных дрожжеподобными грибами, которые у пациента с ослабленным иммунитетом могут определить развитие инфекционного процесса [6]. В условиях такой полиэтиологичности диагностическая значимость бактериологических исследований значительно возрастает.
Для выделения микроорганизмов из аспирата закрытых полостей ЛОР-органов разработан ряд методов, позволяющих обнаружить минимальное количество микроорганизмов в исследуемом материале. Это классические методы посева на питательные среды, приготовленные непосредственно в лаборатории, существенным недостатком которых является невысокий процент высеваемости возбудителя и длительность получения результата. Альтернативным подходом может явиться использование на первых этапах исследования коммерческих питательных сред с последующей инкубацией в бактериологическом анализаторе. Преимуществами такого подхода являются повышение высеваемости, расширение видового разнообразия выделяемых микроорганизмов, снижение риска контаминации образцов.
Одним из наиболее распространенных анализаторов для выделения возбудителей из биологических жидкостей является анализатор BacT/Alert 3D 60, представляющий собой автоматическую систему для культивирования и постоянного мониторинга посева клинического материала во флаконах со специальной средой для выделения аэробных (FA), анаэробных (FN) микроорганизмов, а также для выделения микроорганизмов при посеве малого количества материала (PF).
В доступной нам литературе имеются указания о применении анализатора BacT/Alert только с целью гемокультивирования. В настоящем исследовании мы изучили возможность использования анализатора BacT/Alert 3D 60 для выделения возбудителей из аспирата околоносовых синусов.
Цель: для повышения качества бактериологической диагностики синуситов сравнить эффективность использования автоматизированного метода исследования с классическим бактериологическим методом.
Материалы и методы. Исследования проводили на базе бактериологической лаборатории Городской клинической больницы № 6, г. Челябинск, в учебной лаборатории микробиологии и иммунологии биологического факультета Челябинского государственного университета в период январь - декабрь 2015 г.
Всего изучен 481 образец клинического материала (пунктат, промывные воды пазух), полученного от пациентов с различными формами синусита. Взятие материала осуществлялось посредством пункции синуса и аспирации содержимого в шприц. При невозможности аспирировать содержимое из-за незначительного количества и высокой вязкости, в полость вводился 1 мл стерильного физиологического раствора с последующим взятием материала.
Для автоматизированного посева материал забирался асептично во флакон PF у постели больного. Затем флаконы устанавливали в анализатор и инкубировали до получения сигнала о наличии бактериального роста. В последующем выполняли бактериоскопию содержимого флакона, высев и инкубацию посевов в соответствии с классическим микробиологическим методом исследования отделяемого дыхательных путей [10].
При классическом методе материал в шприце немедленно доставляли в бактериологическую лабораторию, где выполняли посев на 5% кровяной агар, шоколадный агар и тиогликолевую среду, и одновременно производили мазок на стекло для последующей окраски по методу Грама. Все посевы инкубировали в условиях повышенного содержания CO2. При подозрении на анаэробы высев на среду Шедлера инкубировали в условиях повышенного анаэробиоза.
Идентификацию выделенных культур проводили в соответствии с приказом Минздрава СССР от 22.04.1985 №535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» [10].
Полученные данные были обработаны с использованием непараметрического метода - расчет критерия χ2 Пирсона. Различия считались статистически значимыми при χ2>3,841 (при числе степеней свободы 1), что соответствует уровню значимости р≤0,05.
Результаты. На первом этапе работы сравнили скорость получения лабораторного ответа в зависимости от используемого метода посева материала. За время проведения исследования были проанализированы результаты посева 186 проб клинического материала, произведенного по классическому бактериологическому методу и 295 проб, исследованных с применением анализатора. Скорость выявления возбудителей при использовании автоматизированного исследования оказалась на 8 часов короче.
Далее мы оценили процент высеваемости и структуру выделенных из проб микроорганизмов. Применение автоматизированной системы посева позволило увеличить общую высеваемость возбудителей как в монокультуре, так и в микробных ассоциациях (табл.1).
Общая высеваемость при использовании анализатора составила 73,2% (бактериальные культуры выделены в 216 из 295 проб), при классическом бактериологическом методе - 64,5% (120 из 186 проб).
Таблица 1. Высеваемость и скорость выделения бактериальных культур при классическом и автоматизированном методах
Состав микробиоты, выделенной из аспирата околоносовых синусов классическим микробиологическим методом и с использованием анализатора, представлен в табл/ 2. Наибольшая доля высеваемых микроорганизмов относится к представителям родов Streptococcus, Haemophilus и Staphylococcus. Процент высеваемости S.pneumoniae, являющегося преобладающим возбудителем, составил 19,0% при автоматизированном методе и 10,8% при классическом методе посева. Вторым по частоте высеваемости является вид H.influenzae - 12,9% и 5,9%, соответственно. Остальные выделенные микроорганизмы объединены для удобства в родственные группы и распределены следующим образом: бактерии рода Streptococcus - 13,2% при автоматизированном методе и 14,5% при классическом методе исследования; S.pyogenes - 4,4% и 5,4%, соответственно; S.aureus - 4,4% и 7,0%; неплазмокоагулирующие стафилококки - 7,5% и 9,1%; бактерии семейства Enterobacteriaceae - 4,4% и 6,5%; неферментирующие грамотрицательные бактерии - 3,1% и 1,1%; облигатные анаэробы - 2,1% и 1,6%; Enterococcus spр. - 1,4% и 1,6%; грибы рода Candida - 1,0% и 1,1%, соответственно.
Таблица 2. Структура микроорганизмов, выделенных из аспирата при использовании классического и автоматизированного метода
Обсуждение результатов исследования. Бактериальный синусит является распространенной инфекцией, встречающейся как у взрослых, так и у детей, и часто возникающей как осложнение вирусных инфекций верхних дыхательных путей. Многообразие выявляемых микроорганизмов подтверждает важность проведения бактериологического исследования при подозрении на бактериальный синусит. Так как околоносовые синусы в норме стерильны, каждый выделенный микроорганизм, независимо от его титра, рассматривается как потенциальный возбудитель инфекции. Во внимание принимаются свойства выделенного микроорганизма, а также резистентность к антибиотикам. При этом для назначения рациональной антибактериальной терапии большое значение имеет скорость получения результатов исследования. Исходя из приоритетности в составе возбудителей S. pneumoniae и H. influenzae, которые относятся к «требовательным» микроорганизмам, нуждающимся в особом составе питательных сред и условий роста, целесообразным является внедрение условий культивирования, способствующих их выявлению. В данном исследовании мы используем бактериологический анализатор Bact/Alert 3D 60 на этапе посева клинического материала и мониторинга за инкубацией посевов.
По результатам исследований российских и зарубежных авторов, процент выделения микрофлоры из клинического материала при классическом методе посева составляет 60-65% [3, 8, 11], что подтверждается и результатами данной работы - бактериальные культуры выделены в 64,5% исследуемых проб.
Литературные данные об использовании анализатора Bact/Alert с целью исследования аспирата в доступной литературе отсутствуют. Применение в данном исследовании автоматического анализатора Bact/Alert 3D 60 позволило увеличить высеваемость микроорганизмов из исследуемого материала с 64,5% до 73,2% (при сравнении с классическим методом).
Видовой спектр выделяемых при синуситах микроорганизмов достаточно широк. Сведения о структуре возбудителей синусита довольно противоречивы: в некоторых исследованиях ведущими возбудителями указываются S.pyogenes и S. aureus [7], но результаты большинства работ показывают, что именно S. pneumoniae и H. influenzae обнаруживаются чаще других возможных возбудителей синуситов. S. pneumoniae обнаруживается в среднем в 31% (20-35%) случаев, H. influenzae - в 21% (6-26%) [2, 8, 11]. В нашем исследовании высеваемость S. pneumoniae была достоверно выше при использовании анализатора и составила 19,0%, при унифицированном методе - 10,8%. Та же картина наблюдается и в отношении другого приоритетного возбудителя - H. influenzae: 12,9% и 5,9%, соответственно.
При проведении исследования не было выявлено ни одного случая выделения бактерий вида Moraxella catarrhalis, занимающего третье место по частоте встречаемости у пациентов с синуситами [2, 8]. Аналогичные данные встречаются в работе Колосова А.В. [3], низкая высеваемость данного микроорганизма отмечена и в статье Тарасова А.А. [9]. Отсутствие регистрации выделения M. catarrhalis может быть сопряжено с несущественной ролью данного микроорганизма в этиологии синуситов в регионе проведения исследования.
Различия в высеваемости других микроорганизмов представлены повышенным обнаружением облигатных анаэробов (2,1% при автоматизированном методе исследования и 1,6% при классическом), а также снижением получения отрицательных результатов из-за отсутствия роста микроорганизмов (26,8% при автоматизированном методе исследования и 35,5% при классическом), что объясняется оптимальным составом среды в используемых коммерческих флаконах. Кроме того, отмечено снижение выделения неплазмокоагулирующих стафилококков с 9,1% при классическом методе посева до 7,5% при использовании анализатора. По мнению многих авторов, выделенные неплазмокоагулирующие стафилококки следует расценивать как микрофлору полости носа, контаминирующую исследуемый аспират при заборе из околоносовых пазух [1, 4]. Но так как забор клинического материала производится в одинаковых условиях, снижение высеваемости данных микроорганизмов может быть связано с уменьшением вероятности контаминации материала при проведении автоматизированного исследования, так как автоматизированная обработка бактериологических проб происходит с минимальным участием лаборанта, тем самым обеспечивая снижение риска перекрестной контаминации образцов.
Таким образом, использование анализатора Bact/Alert 3D 60 для выделения микрофлоры околоносовых пазух при синусите показало свое преимущество перед применяемым классическим микробиологическим методом.
Выводы
- Анализатор Bact/Alert 3D 60 может быть успешно использован для исследования клинического материала из закрытых полостей и выделения возбудителей инфекций ЛОР-органов.
- Применение автоматизированной системы позволило на 8 часов сократить выделение чистой культуры возбудителей.
- Высеваемость ведущих возбудителей синуситов при использовании автоматической системы достоверно выше, чем при классическом методе исследования, а возможность контаминации клинического материала при использовании анализатора сравнительно ниже, чем при унифицированном методе исследования.