Введение. Язвенно–некротический энтероколит (ЯНЭК) новорожденных – тяжелое заболевание, вызванное продолжительным гипоксически–ишемическим повреждением кишечника с развитием некроза стенки кишки, перитонита и сепсиса. Частота неблагоприятных исходов ЯНЭК достигает 10-50% [1].
Доказанными факторами риска развития летальных исходов ЯНЭК являются недоношенность, ранее начало и увеличенный объем энтеральной нагрузки, бактериальные инфекции, реперфузионно-ишемическое повреждение кишечника. Однако чувствительность и прогностическая ценность указанных факторов риска, особенно на ранних стадиях развития ЯНЭК, достоверно не доказана, и в ряде случаев не нашла клинического подтверждения [2].
В последние десятилетия особую актуальность приобретают математические модели изучения патологических процессов с целью выявления значимых факторов, влияющих на исход заболевания. Матричные металлопротеиназы (ММП) - группа цинк-зависимых ферментов, которые способны гидролизовать основные структурные белки экстрацеллюлярного матрикса, участвовать в деградации коллагена типа IV, который является основным компонентом базальной мембраны. Эластазы, или ММП-2 и ММП-9, синтезируются в латентной форме, их активность стехиометрический регулируется тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (ТИМП). Учитывая многогранность эффектов компонентов системы ММП и ТИМП, их изучение в качестве маркеров прогрессирующего течения ЯНЭК представляется актуальным.
Фекальный кальпротектин (ФК)- неинвазивный количественный прямой маркер активности воспалительного процесса в кишечнике при неспецифических колитах, используется для мониторинга ответа на лечение и выявления рецидивов, доказательства факта вовлечения тонкого кишечника в воспалительный процесс. Установлено, что нейтрофилы и макрофаги, являются самым важным источником внеклеточного кальпротектина, поскольку его содержание в цитоплазме нейтрофилов достигает 60%. Роль и клиническое значение ФК в качестве маркера прогрессирования ЯНЭК до конца не определена.
Мы представляем математическую модель прогнозирования исхода ЯНЭК разработанную с использованием профиля фекального кальпротектина (ФК), матричной металлопротеины-2 (ММП-2), матричной металлопротеиназы–9 (ММП-9) и тканевого ингибитора металлопротеиназ-4 (ТИМП-4), данных клинического обследования и лабораторных показателей.
Ранее установленная значимая роль указанных маркеров в патогенезе заболевания в качестве дополнения к клиническим данным, позволит адекватно определить тяжесть состояния новорожденных с ЯНЭК, выявить ранние признаки заболевания, изменить тактику лечения в зависимости от тяжести состояния новорожденного с ЯНЭК и оценить исход заболевания [3].
Цель исследования: разработать математическую модель прогноза исхода ЯНЭК у новорожденных, построенную на данных клинической картины, результатов лабораторных исследований и иммунологических показателей.
Материалы и методы исследования. В исследование вошли 43 новорожденных с клиническими проявлениями ЯНЭК на разных стадиях [4] в возрасте 1 до 28 дней, проходивших лечение в реанимационном и хирургическом отделениях ГУБ КБСМП №7 г. Волгограда и Волгоградском областном перинатальном центре №2. В динамике оценивались клинические, и лабораторные показатели. Концентрации эластаз (ММП-9, ММП-2) и их ингибитора (ТИМП-4) определяли в плазме крови условно здоровых новорожденных детей (референтная группа), а также при появлении первых клинических и лабораторных симптомов подозреваемого ЯНЭК, в первые часы от поступления в реанимационное отделение у детей с явными и прогрессирующими стадиями заболевания и через 7 дней после оперативного лечения (основная группа или группа наблюдения). Образцы хранили при -20°С, размораживали 1 раз для исследования уровня ферментов с использованием коммерческих наборов для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (Human Human ММР-2 Quantikine ELISA Kit, Human Human ММР-9 Quantikine ELISA Kit Human Human ТIМР-4 Quantikine ELISA Kit, R&D Systems, USA) на иммуноферментном анализаторе (ИФА) ANTHOS 2020 (Австрия). Образцы кала хранили в пластиковых контейнерах однократного применения (без наполнителя) при температуре – 18–20°. Концентрацию фекального кальпротектина (ФК) определяли иммуноферментным методом c помощью набором для ИФА (Buhlmann Laboratories AG, EK-CAL ELISA Kit.).
Статистическая обработка результатов исследований проведена с помощью программы SPSS 13.0 for Windows с применением методов линейного корреляционного, кластерного анализов. Математическое моделирование исходов ЯНЭК проводили методом множественного линейного дискриминантного анализа Фишера. Для отбора информативных признаков выполнялась процедура пошагового включения переменных. Рассчитывали значение Wiiks’Lambda, оценивали полученную сумму классификационных уравнений и адекватность полученной модели.
Достоверность различий в группах оценивалась с помощью непараметрических тестов: Вилкоксона-Манна-Уитни, для категорийных переменных методом Мак-Немара (хи-квадрат). Связь между непрерывными переменными изучали с использованием ранговой корреляции Спирмена. Величины менее 0,05 считали статистически значимыми.
Результаты и обсуждение. При сравнении изучаемых параметров в динамике развития осложнений ЯНЭК обнаружены значимые различия у больных с дохирургическими стадиями и течением заболевания, осложненным перфорацией кишечника.
Появление перфорации сопровождалось увеличением ФК в 46 раз (р<0,01) по сравнению с контролем и в 12 раз в сравнении с больными с клиническими проявлениями ЯНЭК без перфорации. Средние концентрации ММП-2 увеличивались в 8 и 1,6 раза (р<0,01), ТИМП-4 в 5,8 и 1,2 раза соответственно. Средние значения ММП-9 у больных без перфораций и с перфорациями кишечника также увеличивались, однако, без достоверных отличий между группами.
Появление признаков септического процесса сопровождалось увеличением продукции ММП-9 и ТИМП-4 в 2,3 раза (р<0,01) в сравнении таковыми значениями у больных без признаков сепсиса. У пациентов с сепсисом обнаружена сильная положительная корреляционная зависимость между ФК и ММП-2 (r=0,87; р<0,01), менее сильные, но значимые связи выявлены между ТИМП-4 и ММП-2 (r=0,5; р<0,01), ММП-9 (r=0,48; р<0,01), ФК (r=0,48 р<0,01). Обнаружено, что случаи гибели пациентов с признаками септического процесса сопровождались значительным (р<0,01) увеличением средних концентраций ТИМП-4 (2085 нг/мл) и ММП-9 (1032 нг/мл). У пациентов без признаков сепсиса и летальным исходом средние концентрации ТИМП-4 и ММП-9 составили 1306 нг/мл и 668 нг/мл соответственно.
В динамике лечения у выздоровевших пациентов отмечалось достоверное снижение средних концентраций ФК в 2,3 раза (p<0,01), ММП-2 в 1,5 раза (p<0,01) и ТИМП-4 в 1,5 раза (p<0,05), которое, однако, оставалось значительно выше контрольных значений. Несмотря на выявленное недостоверное повышение средних концентраций ММП-9, в 1,1 раза обнаружена обратная корреляциооная зависимость (r=- 0,55; р<0,05) между значениями ММП-9 до и через 7 дней после начала лечения.
Обнаруженные нами закономерности, доказывающие патогенетическое значение ФК, ММП-2, ММП-9 и ТИМП-4 в патогенезе осложнений ЯНЭК у новорожденных, позволяют включить их, наряду с клиническими и лабораторными показателями в статистический анализ, для построения математической модели прогнозирования исходов заболевания.
При построении дискриминантной модели с учетом полученных данных была сформирована выборка, включающая новорожденных детей известным исходом заболевания, определенным как зависимая переменная (1 — выздоровление, 2— гибель). В качестве независимых переменных были использованы клинические показатели, данные лабораторных и иммунологических тестов.
Проведенный регрессионный анализ для определения анализируемых иммунологических параметров, которые могут быть использованы как предикторы смертности при осложненном течения ЯНЭК у новорожденных показал, что площади под кривыми были следующими: кальпротектин (AUC=0,92, 95% ДИ=0,84 до 0,92; P<0,001), TИMП-4 (AUC=0,74, 95% ДИ=0,62 до 0,97; P <0,001), ММП-2 (AUC=0,95, 95% ДИ=0,9 до 0,99; P<0,001), ММП-9 (AUC=0,68, 95% ДИ=0,52 до 0,84; P<0,003). Оптимальные значения для каждого предиктора летальности составили: ФК>816 мкг/г, ММП-2>503 нг/мл, ММП-9>812 нг/мл, ТИМП-4>1404 нг/мл. Чувствительность теста составила 94%, специфичность 87%, что характеризует высокое качества предлагаемого нами способа определения исхода ЯНЭК. Отличное качество характеристической кривой установлено для уровней ФК и ММП-2, хорошее - для ТИМП-4, среднее - для ММП-9.
Получена математическая модель прогнозирования исходов ЯНЭК с канонической корреляцией 0,859 и значимым (p<0,0001) различием дискриминантных функций, что указывает на высокую статистическую значимость (Wilks’ Lambda: -0,263; F=50,758 при p<0,0001) комплексного влияния выбранных переменных на вероятность исхода заболевания.
При проведении дискриминантного анализа с пошаговым добавлением показателей, улучшающих качество модели, просматривали 76 переменных с определением наиболее значимых, влияющих на различия между совокупностями. После этого включали значимую переменную в модель и переходили к следующему этапу анализа. Эти параметры выбраны в соответствии с современным уровнем комплексной клинической, лабораторной и инструментальной диагностики осложнений ЯНЭК. Использование этого варианта дискриминантного анализа позволило осуществить редукцию переменных до шести. Уменьшение количества используемых параметров не привело к снижению качества и значимости модели исхода заболевания, что свидетельствует о хорошей дискриминации и корректности предложенного алгоритма.
Прогноз исхода ЯНЭК у новорожденных при поступлении вычисляли по формуле:
d=-7,148+X1*(0,915)+X2*-0,292+X3*0,005+X4*0,002+Х5*0,001+Х6*0,201,
где X1 –характеристика лейкоцитарной формулы (регенераторный сдвиг, лейкопения, нормопения), Х2 – наличие или отсутствие сопутствующего поражения дыхательной системы, Х3 - сывороточный уровень ММП-2 (нг/мл), Х4 –концентрация ФК (мкг/г), Х5-сывороточный уровень ТИМП-4 (нг/мл), Х6 – значение шкалы оценки тяжести полиорганных нарушений SOFA (в баллах).
Точность корректного прогноза предлагаемой модели составила 93% (табл.1).
Таблица 1. Классификационная таблица предсказанных и наблюдаемых исходов ЯНЭК у новорожденных детей
Интерпретация результатов: прогноз пациента будет относиться к тому классу, для которого классифицированное значение уравнения, в сравнении с другим будет выше, что позволяет констатировать риск развития летального исхода новорожденных с осложненным течением ЯНЭК. При распределении значений групповых центроидов в диапазоне от 0 до -1,258 больного можно отнести к группе выживших, а при величинах групповых центроидов в диапазоне от 0 до 2,124 больного можно отнести к группе с высокой вероятностью летального исхода.
Пример 1. Новорожденный Н. поступил в отделение реанимации с клиникой перфорации кишечника на фоне осложненного течения ЯНЭК. Рассчитанная константа составила -0,945>-1,258, что указывает на достаточно высокую вероятность выздоровления, независимо от выбранного способа лечения и продолжительности предоперационной подготовки.
Пример 2. Для новорожденного А., с осложненным перфорацией кишечника течением ЯНЭК и похожими клиническими показателями, включенными в математическую модель, расчетная константа составила 1,62<2,124, что указывает на высокую вероятность летального исхода, даже при кратковременной предоперационной подготовке, направленной на стабилизацию основных жизненных и лабораторных показателей, что подтвердилось в дальнейшем.
Заключение. Высокая специфичность метода, предназначенного для прогноза исходов ЯНЭК у новорожденных детей, дает возможность использовать его для выявления факторов, определяющих высокий риск в периоперационном периоде и непосредственно предрасполагающих к формированию неблагоприятного прогноза, оценить выраженность полиорганных нарушений, изменить тактику лечения и сроки предоперационной подготовки с целью улучшения результатов лечения ЯНЭК у новорожденных.