Введение. Имеющиеся в настоящий момент сведения о клинико-функциональном статусе новорожденных в раннем неонатальном периоде при перинатальной гипоксии и роли в его нарушении системы матриксных металлопротеиназ (ММП) и системных сдвигов метаболизма носят отрывочный характер, методологически разнородны и противоречивы [1,2].
Целью настоящего исследования явилось изучение динамики матриксных металлопротеиназ в крови новорождённых детей в раннем неонатальном периоде для диагностики гипоксических поражений центральной нервной системы.
Материалы и методы исследования. В основу работы положены результаты обследования 124 детей, 74 из которых родились преждевременно, основную группу составили 25 детей с гипоксически-ишемическим поражением центральной нервной системы (ЦНС), группу сравнения - 25 детей с геморрагическим поражением ЦНС и контрольную группу составили 24 условно здоровых недоношенных ребёнка. У доношенных детей основную группу составили 25 детей с церебральной ишемией I-II степени, группу сравнения - 25 условно здоровых детей.
При проведении данного исследования использовался комплекс клинических, ультразвуковых (нейросонография) и лабораторных методов (иммуноферментное определение концентраций матриксных металлопротеиназ 1, 9 (ММП-1 и ММП-9) и тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ (ТИМП-1).
Оценка неврологического статуса проводилась по общепризнанной методике, нейросонография новорождённым детям проводилась на аппарате Vivi-i (General Electrics, США), исследование проводилось с помощью линейного 12v и конвексного 8v датчиков, использовалась общепринятая методика: через большой родничок и височную кость в различных плоскостях.
Для проведения иммуноферментного анализа использовались наборы RayBio® ELH-MMP1-001, RayBio® ELH-MMP9-001 и RayBio® ELH-ТИМП1-001 (RayBiotech, США). Концентрации ММП-1, ММП-9 и ТИМП-1 определялись в плазме пуповинной и плазме венозной крови на 3-4-й день жизни. Для выявления относительных изменений в системе матриксных металлопротеиназ вычислялись отношения концентраций ММП-1/ТИМП-1 и ММП-9/ТИМП-1.
Клиническая картина гипоксического поражения центральной нервной системы у новорожденных детей неспецифична, поэтому признаки поражения ЦНС регистрировались в форме синдромов угнетения или возбуждения.
Статистический анализ полученных результатов исследования проводился с использованием пакета SigmaPlot 11. Достоверность межгрупповых различий оценивались по U-критерию Манна-Уитни, различие параметров в динамике - по критерию Вилкоксона.
Результаты и обсуждение. Учитывая последние данные о важной роли внеклеточной протеолитической системы в регуляции ремоделирования соединительной, в частности, нервной ткани [4,5], нами проведено проспективное комплексное исследование клинического статуса в раннем неонатальном периоде у новорожденных детей с параллельным определением специфического профиля системы матриксных металлопротеиназ у новорожденных детей. В ходе исследования установлены достоверно высокие показатели ферментов протеолитической системы у недоношенных детей (табл. 1) в 1 и 2 группах в плазме пуповинной крови в сравнении с детьми, не имеющих гипоксического поражения центральной нервной системы. У недоношенных детей 2-й группы с гипоксически-геморрагическим поражением ЦНС в плазме пуповинной крови концентрация ММП-1 составила 0,38±0,012 нг/мл, что достоверно (р<0,01) превышало данные в 3 группе (0,28±0,016 нг/мл), но была сопоставима с данными в 1 группе (0,32±0,012 нг/мл). Также отмечается достоверное повышение (р<0,01) концентрации ММП-9 в 1-й (104,0±4,8 нг/мл) и 2 группах (118,4±8,75 нг/мл) в сравнении с 3-й (92,23±2,08 нг/мл), данные 1 и 2 групп статистически сопоставимы. Однако ТИМП-1 (30,7±1,51 нг/мл) в 3 группе в плазме пуповинной крови был достоверно выше (р<0,01), чем в 1 и 2 группах (23,5±1,47нг/мл и 24,4±2,31 нг/мл, p>0,05). Представленные данные свидетельствуют о повышении протеолитической активности матриксных металлопротеиназ у новорожденных с перинатальной гипоксией. Подтверждением этого феномена является достоверно значимое повышение отношений в плазме пуповинной крови концентраций ММП-9/ТИМП-1 в 1 и 2 группах в сравнении с 3-й (р<0,01) и повышение отношений ММП-1/ТИМП-1 в 1 и 2-й группах в сравнении с 3-й без достоверной значимости (р>0,05). Изменения уровней матриксных металлопротеиназ и их тканевого ингибитора ТИМП-1, ранее отмечаемые и другими исследователями [6,7], при гипоксии объясняются повышенной продукцией матриксных металлопротеиназ клетками соединительной ткани на уровне транскрипции и трансляции [8]. С точки зрения патогенеза эти данные указывают на возможную связь между перинатальным гипоксическим повреждением ЦНС и активацией системы матриксных металлопротеиназ, что и прослеживается в нашем исследовании.
Таким образом, нами обнаружено, что наибольшая активность протеолитической системы в плазме пуповинной крови наблюдалась у недоношенных детей с гипоксическим поражением центральной нервной системы, особенно у детей 2 группы с гипоксически-геморрагическим поражением ЦНС.
По данным исследований последних лет [5,9,10] известно, что изменения в системе матриксных металлопротеиназ после первичного стимула (гипоксия, цитокины) могут происходить с некоторой задержкой. Принимая во внимание эту особенность, повреждения ЦНС при перинатальной гипоксии нами была оценена динамика этих показателей в сравнении с исходным уровнем при рождении. Отмечается более высокая (р<0,01) концентрация ММП-1 на 3-4-й день жизни в плазме венозной крови у детей 1 (0,4±0,02 нг/мл) и 2 группы (0,4±0,02 нг/мл) в сравнении с 3-й (0,3±0,02 нг/мл), данные в 1 и 2 группах не имеют статистических различий. Наибольшая активность ММП-9 на 3-4-й день наблюдается у детей 2 группы (188,6±14,31 нг/мл), концентрация которой значительно выше (р<0,01 и р<0,05), чем у детей 1-й (108,9±4,99 нг/мл) и 3-й групп (74,43±3,69 нг/мл). В 1 и 2 группах в тоже время отмечается более высокая (р<0,01 и р<0,05) концентрация ТИМП-1 (26,9±1,82 нг/мл 43,8±3,18 нг/мл) в сравнении с 3-й (16,96±1,51 нг/мл), между 1 и 2 группами (р<0,05) также отмечается статистическая разница. Представленные данные свидетельствуют о повреждении мембран клеток с повышением проницаемости гематоэнцефалического барьера.
Таблица 1. Динамика показателей протеолитической системы матриксных металлопротеиназ на 3-4-й день жизни у недоношенных детей, M±m
Примечание: по U-критерию Манна-Уитни, * - достоверность различий (р<0,05) при сравнении 1 и 2 групп, ** -достоверность различий (р<0,05) при сравнении 2 и 3групп, # - достоверность различий (р<0,05) при сравнении 1 и 3групп на 3-й день жизни, ¹ - достоверность различий (р<0,05) при сравнении полученных данных в плазме пуповинной и венозной крови на 3-4-й день жизни в группах (по критерию Вилкоксона).
Мы исследовали динамику показателей матриксных металлопротеиназ у новорожденных с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС в раннем неонатальном периоде и без такового. В нашем исследовании отмечается продолжение активации ММП-1 в 1 и 2 группах и снижение концентрации в 3 группе без достоверно значимых различий (р>0,05) в сравнении с исходными данными. Сравнивая концентрации ММП-9 на 3-4-й день с исходной очевидно увеличение без достоверной значимости у детей 1 группы (р>0,05), тогда как отмечается достоверно значимый (р<0,001) рост концентрации MMП-9 у детей 2 группы, но достоверно значимое (р<0,05) снижение в 3 группе. Представленные данные демонстрируют, что процесс повреждения центральной нервной системы у детей 2-й группы с гипоксически-геморрагическим поражением продолжается, что свидетельствует о сохраняющемся иммунопатологическом процессе на клеточно-тканевом уровне у этой категории детей. Активность продолжающегося процесса повреждения на 3-4-й день у детей 2 группы подтверждается значимым (р<0,05) повышением концентрации ТИМП-1 в плазме венозной крови. У детей 1 группы также продолжается повышение концентрации ТИМП-1 без достоверной значимости в сравнении с исходной, однако у детей 3 группы отмечается статистически значимое (р<0,001) снижение концентрации. Следовательно, чем больше концентрация ММП, тем больше возникает потребность в его ингибиторе.
Сравнительный анализ параметров системы матриксных металлопротеиназ у доношенных детей (таблица 2) при рождении показал, что у доношенных детей с гипоксическим поражением ЦНС в сравнении со здоровыми в плазме пуповинной крови концентрации ММП-1 были сопоставимы и составили 0,31±0,01 нг/мл и 0,28±0,015 нг/мл. Однако концентрация ММП-9 у детей 1 группы составила 100,8±6,0 нг/мл и была достоверно (p<0,05) выше данных 2 группы - 77,5±3,6 нг/мл, в то же время концентрация их тканевого ингибитора ТИМП-1 была ниже (25,8±1,5 нг/мл против 27,3±1,3 нг/мл, p>0,05). Это косвенно свидетельствует о наличии нарушений у новорожденных с перинатальной гипоксией - повышенной протеолитической активности матриксных металлопротеиназ [11-14]. Подтверждением этого феномена является повышение отношений в плазме пуповинной крови концентраций ММП-1/ТИМП-1 (0,013±0,001 нг/мл и 0,012±0,0009 нг/мл) и ММП-9/ТИМП-1 в 1 группе (4,45±0,46 нг/мл и 3,17±0,29 нг/мл), однако достоверной разницы в отношениях между группами выявлено не было. С точки зрения патогенеза эти данные указывают на возможную связь между перинатальным повреждением ЦНС и активацией системы матриксных металлопротеиназ.
На 3-4-й день жизни в нашем исследовании, как и у недоношенных детей, отмечается продолжение активации системы матриксных металлопротеиназ. Продолжает увеличиваться концентрация ММП-1 (0,32±0,02 нг/мл против 0,25±0,001 нг/мл, р>0,05), но без достоверных различий в группах, концентрация ММП-9 в плазме пуповинной крови достоверно выше у детей в 1 группе (104,6±11,0 против 73,1±3,8, р<0,05). В то же время достоверно значимо отмечается повышенная концентрация ТИМП-1 в 1 группе наряду со снижением во 2 группе (23,3±2,7 нг/мл против 15,7±0,7 нг/мл, р<0,05). Однако достоверных различий в группах соотношений ММП-1/ТИМП-1 и ММП-9/ТИМП-1 (р>0,05) как и в 1 сутки не выявлено.
Таблица 2. Динамика системы матриксных металлопротеиназ на 3-4-й день жизни у доношенных детей, М±m
Примечание: *- р<0,05.
Рассматривая взаимосвязь синдромов и системы матриксных металлопротеиназ в нашем исследовании (таблица 3), было очевидно, что достоверной разницы между концентрациями ММП-1 у доношенных и недоношенных детей в плазме пуповинной крови не выявлено (при угнетении р=0,675, при возбуждении р=0,148). В тоже время достоверно значимо (р=0,012) отмечается повышение концентрации ММП-1 в плазме венозной крови на 3-4-й день жизни у недоношенных детей при синдроме угнетения, а у доношенных снижение-при синдроме возбуждения (р=0,443). Табл. 3 демонстрирует продолжающуюся активацию ММП-9 у недоношенных детей на 3-4-й день с достоверностью различий (110,11±4,838 нг/мл и 143,88±10,333 нг/мл, р=0,002 и 117,89±19,669 нг/мл и 178,56±28,468 нг/мл, р=0,023) при различных синдромах, однако у доношенных детей продолжение активации наблюдается только при синдроме угнетения (с 122,34±9,606 нг/мл до 145,51±20,321нг/мл, р=0,292). В плазме пуповинной крови концентрация ТИМП-1 у детей исследуемых групп достоверно значимых различий при синдромах не имела. А в плазме венозной крови у недоношенных детей на 3-4-й день жизни при угнетении и возбуждении отмечается достоверное повышение концентрации ТИМП-1 (23,94±1,454 и 34,88±2,394, р<0,001, 24,04±3,499 и 28,23±4,621, р=0,023). У доношенных детей при синдроме возбуждения на 3-й день отмечается достоверно значимое снижение концентрации ТИМП-1 (р=0,016) в сравнении в сравнении с исходной. Однако у недоношенных детей при синдроме возбуждения на 3-й день жизни в плазме венозной крови концентрация ТИМП-1 в сравнении с доношенными была значительно выше (р<0,001).
Таблица 3. Взаимосвязь синдромов и протеолитической системы матриксных металлопротеиназ, M±m
Примечание: по U-критерию Манна - Уитни: * - достоверность различий (р<0,05) при сравнении синдромов угнетения и возбуждения в группах доношенных или недоношенных детей, ** - достоверность различий (р<0,05) при сравнении синдрома возбуждения у недоношенных и доношенных детей. По критерию Вилкоксона сравнивались исходные данные с данными на 3-4-й день жизни.
Таким образом, максимальная активность ММП-1 наблюдалась у детей в группах с синдромом угнетения на 3-й день, также на 3-й день отмечалось и увеличение концентрации ММП-9, однако наибольший уровень наблюдался у недоношенных детей с синдромом возбуждения. Минимальная концентрация тканевого ингибитора ММП (ТИМП-1) была у доношенных детей с синдромом возбуждения на 3-й день.
Выводы
1) У детей с гипоксическим поражением центральной нервной системы отмечаются повышенные концентрации матриксных металлопротеиназ (ММП-1,-9) и пониженный уровень ТИМП-1 в плазме пуповинной крови в сравнении со здровыми детьми.
2) На 3-4-й день жизни у доношенных и недоношенных детей с гипоксическим поражением центральной нервной системы в плазме венозной крови отмечается повышение концентрации ММП-1, ММП-9 и ТИМП-1 в сравнении с исходными данными, тогда как у здоровых новорождённых они снижаются.
3) На 3-4-й день жизни в плазме венозной крови у недоношенных детей при синдроме угнетения отмечается достоверно значимое повышение концентраций матриксных металлопротеиназ (ММП-1,-9) и тканевого ингибитора (ТИМП-1).