Введение
Альфа-фетопротеин (АФП), участвуя в регуляции процессов апоптоза, выполняет иммуномодулирующую функцию [2], что позволяет предположить его участие в неонкологических состояниях, сопровождающихся повреждением клеток, каковыми являются ОКР (обсессивно-конвульсивные расстройства) [1].
Цель исследования: изучить двигательную активность мышей линии СВА, выявить различия в поведенческой активности при введении альфа-фетопротеина (АФП) и на фоне введения Флуоксетина (ФЛ), на модели психоэмоционального стресса в тестах «принудительного плавания» и «закапывания шариков».
Материалы и методы
Альфа-фетопротеин сухой - оригинальное патентованное дозированное лекарственное средство, основным действующим веществом которого является лиофилизированный порошок альфа-фетопротеина [2].
АФП предварительно растворяют в 0,9% растворе натрия хлорида. Оценку биологической активности раствора АФП проводили на белых беспородных мышах массой 18-25 г, содержащихся в типовом виварии. Их питание осуществлялось в соответствии с нормами кормов для экспериментальных животных. Группы для исследования формировались методом случайной выборки с учетом массы тела в качестве определяющего показателя. Исследование противовоспалительной и иммунотропной активности осуществляли в соответствии с методическими указаниями [9].
Рис. 1. Дизайн проведения скрининга анксиолитической активности Альфа-фетопротеина: в/бр - внутрибрюшинно; АФП - Альфа-фетопротеин; ФЛ – Флуоксетин
Животные были разделены на четыре группы по 10 особей:
- мыши, находившиеся в естественных условиях освещения, которым вводили эквиобъемное количество изотонического раствора хлорида натрия внутрибрюшинно (0,5мл), - интактная группа (0);
- мыши, находившиеся в естественных условиях освещения, которым однократно внутрибрюшинно ввели раствор АФП в дозе 0,00375 мг/кг в объеме 0,5 мл - для оценки показателей состояния поведенческой активности, - опытная группа (1);
- мыши, находившиеся в естественных условиях освещения, которым для моделирования экспериментального десинхроноза вводили внутрибрюшинно 0,5мл раствора ФЛ в дозе 10 мкг/кг в объеме 0,5мл, - опытная группа (2);
- мыши, находившиеся в естественных условиях освещения, которым внутрибрюшинно вводили раствор АФП в дозе 0,00375 мг/кг в объеме 0,5мл, через 30 минут после предварительного введения раствора (ФЛ).
Показатели двигательной активности всех групп животных оценивали через 30 минут после введения апробируемых препаратов (опытные группы 1,2,3) и изотонического раствора, - опытная группа (0).
Для анализа поведенческой активности животных использовали тесты принудительного плавания (Порсолта).
Экспериментальная установка представляла собой набор из 5 пластиковых цилиндров высотой 30 см и диаметром 10 см, которые заполняли водой температурой 25±1о С до отметки 20 см. Смена воды осуществлялась после каждой группы животных. За 24 ч. до теста проводили сеанс предварительного плавания длительностью 5 мин. Время проведения теста для одной группы мышей составляло 5 мин., в рамках которого выделяли периоды клайминга, плавания и иммобилизации. Плавание - активное использование животным передних лап (без подъема над поверхностью воды) для передвижения вперед, в центр или вдоль стенок цилиндра. Иммобилизация - отсутствие активности, кроме той, что была необходима для поддержания головы над поверхностью воды: движения хвостом или ограниченные движения конечностями. Клайминг - направленные вверх движения передних лап вдоль стенок цилиндра.
Моделью изучения индивидуальных особенностей, выбрана методика «Закапывания шариков», которую используют для исследования выраженности обсессивно-компульсивного (ОКР-подобного) поведения мышей и для скрининга антикомпульсивных препаратов, поскольку он отвечает таким критериям моделей психопатологий, как predictive (соответствующая фармакологическая коррекция) и face (поведенческая симптоматика) validity. Считается, что животные используют доступный материал подстилки, чтобы закопать нежелательные источники дискомфорта, находящиеся в домашнем окружении.
В качестве экспериментальной установки использовали индивидуальные поликарбонатные боксы для грызунов (31,5х23х15,7 см), которые на 5 см заполняли плотно утрамбованными опилками. В экспериментальной комнате поддерживали минимальный уровень шума и освещение в 100 лк. Предварительно животных помещали в индивидуальные боксы с подстилкой на 30 мин с целью ознакомления. После предварительной посадки опилки вновь утрамбовывали и помещали на них 9 стеклянных шариков диаметром 1,5 см (по схеме 3 на 3). Мышей помещали в индивидуальные боксы с шариками на 30 мин, по истечении которых подсчитывали количество зарытых шариков (зарытыми считались шарики, погруженные в подстилку на 2/3.
Достоверность различий между группами определяли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни, используемого для двух независимых выборок. Различия считались статистически значимыми при p<0,05 [10]. Статистическая обработка полученных результатов проводилась на основе пакета программ StatSoftStatistica v. 8.0. При обработке результатов группы проверяли на нормальность распределения исследуемого признака. Исследуемые признаки не подчинялись нормальному распределению, поэтому для дальнейшего расчета использовали непараметрические критерии: медиана (Ме) и квартили (Q1 - 25%; Q3 - 75%).
Результаты и их обсуждение
В проведенных нами исследованиях в тесте «принудительного плавания» было установлено, что интактные животные первой группы характеризовались относительно высоким уровнем активного плавания и клайминга (Кл 2,8±0,2; Пл 2,4±0,4).
У мышей второй группы после введения раствора ФЛ в дозе 10 мг/кг в объеме 0,5мл выявлено снижение двигательной активности (активного плавания и клайминга) по сравнению с интактной группой - это свидетельствует об угнетающем действии на ЦНС животных: ФЛ (Кл 0,8±0,2; Пл 0,8±0,2) по сравнению с контролем (Кл 2,8±0,2; Пл 2,4±0,4) (p1< 0,001) (табл. 1).
Введение животным раствора АФП в дозе 0,00375 мг/кг в объеме 0,5 мл способствовало коррекции изучаемых показателей исследовательской активности: АФП повышал суммарную двигательную активность - об этом свидетельствует наличие достоверных отличий: АФП (Кл 2,6±5,1; Пл 3,4±0,2) по сравнению с интактными (p1< 0,05) (табл. 1).
У мышей четвертой группы АФП-ФЛ по сравнению с интактной группой и ФЛ возрастала двигательная активность как за счет клайминга, так и за счет активного плавания: увеличилась двигательная активность в группе АФП по сравнению с интактными животными (p1< 0,001), и с группой ФЛ (p1<0,001)
Таблица 1. Тест «принудительное плавание»
Примечание: здесь и далее * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001; 1 - по сравнению с контролем; 2 - по сравнению с Флуоксетином.
Для изучения анксиолитических свойств АФП в тесте «закапывание шариков», в условиях психоэмоционального стресса животные были разделены на 4 экспериментальные группы: 1-я группа, - интактная; 2-я группа, - животные, получавшие ФЛ в дозе 10 мкг/кг в объеме 0,5мл; 3-я группа - мыши, которым однократно внутрибрюшинно ввели АФП в дозе 0,00375 мг/кг в объеме 0,5 мл; 4-я группа - животные, которым вводили раствор АФП в дозе 0,00375 мг/кг в объеме 0,5 мл через 30 минут после введения раствора ФЛ в дозе 50 мкг/кг в объеме 0,5 мл.
Исследования показали, что введение АФП по сравнению как с интактными животными увеличивает количество закопанных шариков - это объясняется уменьшением тревожных реакций, о чем свидетельствует наличие достоверных отличий АФП 44%; интактные 30% (p<0,001); так и по сравнению с ФЛ: АФП 40% с ФЛ 11%, что свидетельствует об уменьшении тревожных реакций (p<0,001) (табл. 2)
Животные 2-й группы ФЛ продемонстрировали усиление тревожных реакций, которые проявились в сокращении суммарной двигательной активности и количества закопанных шариков (p< 0,001).
Группа животных с АФП увеличила двигательную активность, и активно-поисковую составляющую поведения (закапывание шариков), о чем свидетельствует наличие достоверных отличий АФП (44%), интактные 33% (p<0,05), по сравнению с ФЛ АФП 44% ФЛ 11% (p<0,001); табл. 2.
Таблица 2. Тест «закапывание шариков»
Ранее было показано, что Альфа-фетопротеин (АФП) выполняет защитную функцию, участвует в регуляции процессов апоптоза, обладает иммуномодулирующей активностью [2].
В настоящее время основными областями применения АФП являются онкологический и пренатальный скрининг [2]. При этом биологическая функциональность АФП позволяет предположить его участие не только в опухолевых процессах, но и в неонкологических состояниях, сопровождающихся повреждением клеток, каковыми являются ОКР [1].
Флуоксетин - это антидепрессант, который относится к группе селективных ингибиторов обратного захвата. Данный препарат назначается при навязчивых и депрессивных состояниях. применяется для лечения тревожных расстройств, но их комплексное применение в данной работе проводилось впервые. Оба препарата разрешены и используются в РФ.
Механизм действия флуоксетина заключается в частичном подавлении обратного захвата серотонина. После однократного приема уменьшается чувство тревоги и страха, происходит повышение концентрации препарата в синаптической щели и усиление его действия. Последующее его взаимодействие с серотониновыми рецепторами, обусловливает как его анксиолитический эффект, так и вызываемые им неблагоприятные побочные реакции. Можно предположить, что благодаря относительно низкому сродству к серотониновым сайтам и высокой скорости биодеградации [3], через серотониновые рецепторы гликопротеин АФП запускает внутриклеточные процессы, приводящие к снижению тревожности, но седативный эффект на фоне введения ФЛ развиться не успевает. Для препаратов пептидной природы характерна множественность механизмов действия, и способность селективно оказывать биологические эффекты в условиях нарушения гомеостаза [4]. Анксиолитическое действие АФП может быть связано также и с нивелированием нежелательных явлений действия флуоксетина.
Таким образом, наши исследования показали, что поведенческие изменения, происходящие под действием АФП, говорят о наличии анксиолитической активности последнего в условиях психоэмоционального стресса, что согласуется с данными литературы о нивелировании последствий умеренного стресса на моделях тревоги у грызунов [5]. Возможно предположить, что в соответствии с экспериментальными данными, АФП стимулирует экспрессию мозговых нейротрофических факторов, в частности BDNF в гиппокампе [8], что объясняет механизм его ноотропного и нейропротективного действия.
Выводы
1. Было установлено, что АФП существенно нивелирует угнетающее действие флуоксетина на когнитивные функции.
2. Терапевтический эффект АФП возможно связан с его иммуномодулирующей способностью [2]. Нарушение иммунных процессов в ЦНС как одного из звеньев патогенеза психических заболеваний [5,6] представляет особый интерес в свете понимания психофармакологического действия АФП. Было показано, что послеэкспрессия ряда генов, задействована в регуляции воспалительных процессов [2].
Нейрохимические механизмы взаимодействия центральной нервной и иммунной систем зависят от состояния иммунного и нейромедиаторного гомеостаза. [7].Так применение АФП в качестве анксиолитического средства, расширяет возможности терапии расстройств тревожного спектра так и коррекции нежелательных эффектов ИОЗС препаратов.
3. Применение АФП, обосновывает целесообразность его использования при стрессе, характеризующимся психоэмоциональным напряжением и агрессивностью.