Регуляция устойчивости функций митохондрий к ишемии-реперфузии при адаптации крыс к хронической гипоксии

Научно-исследовательский институт кардиологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр

Томский государственный университет

Введение. Повышение устойчивости миокарда к ишемическому и реперфузионному повреждению, являющемуся центральным звеном патогенеза ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда, представляет важнейшую задачу экспериментальных и клинических исследований в медицине. Одним из эффективных методов, способных существенно повысить толерантность сердца к ишемии-реперфузии является адаптация к гипоксии [1, 11]. Ранее было продемонстрировано, что в сыворотке крови у адаптированных к хронической непрерывной гипоксии (ХНГ) животных повышается содержание эндогенных опиоидных пептидов [11]. Кроме того, в предыдущем исследовании удалось обнаружить, что в реализации кардиопротекторного эффекта адаптации к ХНГ принимают участие кардиальные опиоидные рецепторы [10]. При этом защитное действие адаптации к данному виду хронической гипоксии проявлялось увеличением устойчивости функций митохондрий к моделированию глобальной ишемии и реперфузии изолированного сердца у крыс [10]. Одним из важных показателей функциональной состоятельности миокардиальных митохондрий являются устойчивость МРТ-поры (mitochondrial transmembrane potential pore) и трансмембранного потенциала (Δψ) к ишемии-реперфузии. МРТ-пора представляет собой канал внутренней и внешней мембраны митохондрий, пропускающий некоторые ионы (например, ионы кальция), а также белки и пептиды размером до 1,5 кДа [6]. Устойчивость МРТ-пор к избытку ионов кальция во время реперфузии миокарда является важным показателем жизнеспособности кардиомиоцитов, поскольку открытие МРТ-поры способно запускать апоптоз или некроз [6]. Оставалось неясным, какие конкретно субтипы кардиальных опиоидных рецепторов принимают участие в реализации механизма кардиопротекции, а именно - способны повышать устойчивость МРТ-пор и трансмембранного потенциала митохондрий миокарда к действию ишемии и реперфузии.

Цель работы - исследовать участие δ1, δ2, μ и κ-кардиальных опиоидных рецепторов регуляции устойчивости функций митохондрий миокарда к действию глобальной ишемии и реперфузии изолированного сердца у крыс, адаптированных к хронической непрерывной гипоксии.

Материалы и методы исследования.

Эксперименты проведены на крысах-самцах линии Вистар массой 250-300 г. Исследование выполнялось в соответствии с рекомендациями, изложенными в Приказе МЗ СССР за № 755 от 12 августа 1977 г., а также принятыми в Хельсинской декларации 1975 г. и дополненными в 1983 г. Исследования были одобрены этическим комитетом НИИ кардиологии. Все болезненные процедуры осуществляли на наркотизированных эфиром животных. Количество особей в каждой группе составило 12. Крыс адаптировали в гипоксической камере к хронической непрерывной гипоксии в течение 21 суток при 12% содержании кислорода и нормальном атмосферном давлении [11]. Газовый состав дыхательной смеси контролировался с помощью датчиков TCOD-IR и OLC 20 (Oldham, Франция) и аппарата «Био-нова-204G4R1» (НТО «Био-нова», Москва) через блок управления МХ 32 (Oldham, Франция). За 24 часа до начала эксперимента адаптированных крыс извлекали из гипоксической камеры. Крысы неадаптированных групп содержались в стандартных условиях вивария при постоянном доступе к воде и корму. На изолированном сердце у крыс моделировали глобальную 45-минутная ишемию и 30-минутную реперфузию. Сердца интактных особей перфузировали в течение 95 минут (интактные). С целью оценки участия кардиальных δ1, δ2, μ и κ-опиоидных рецепторов (ОР) в реализации защитного эффекта ХНГ за 10 минут до глобальной ишемии изолированные сердца крыс перфузировали растворами селективных антагонистов ОР: селективный антагонист δ1-ОР BNTX (1 нмоль/л) [12]; селективный антагонист δ2-ОР налтрибен (1 нмоль/л) [4]; селективный антагонист µ-ОР CTAP (100 нмоль/л) [8]; селективный антагонист κ-ОР норбиналторфимин (norBNT) (3 нмоль/л) [7].

Из миокарда левого желудочка митохондрии изолировали методом дифференциального центрифугирования в сахарозном буфере [2]. Миокард гомогенизировали в растворе, содержащем 70 ммоль сахарозы, 210 ммоль маннитола, 6 ммоль EGTA, 10 ммоль HEPES и 5 мг/мл БСА (бычий сывороточный альбумин), рН 7,38. Полученный гомогенат центрифугировали 10 минут при 900 g. Надосадочную жидкость центрифугировали 10 минут при 12000 g. Осадок, содержащий митохондрии, ресуспендировали в буфере без БСА, затем центрифугировали 10 минут при 12000 g. Осадок, содержащий митохондрии, ресуспендировали в изоляционном буфере без EGTA и БСА. Содержание белка в суспензии митохондрий определяли по методу Брэдфорд [3].

Устойчивость МРТ-пор к ишемии-реперфузии оценивали по способности изолированных миокардиальных митохондрий поглощать и удерживать ионы кальция (кальций-связывающая способность, КСС, нмоль CaCl2/мг белка митохондрий). Кальций-связывающую способность митохондрий измеряли на спектрофлуориметре «Shimadzu RF-5301-PC» с использованием кальций-чувствительного флуоресцентного зонда Calcium Green 5N (Invitrogen, Molecular Probes Inc.) при длинах волн поглощения 506 нм и излучения 532 нм [5]. К суспензии митохондрий добавляли дробно по 100 нмоль хлорида кальция до тех пор, пока МРТ-пора не открывалась, что регистрировалось как максимальное возрастание флуоресценции. КСС рассчитывали по количеству поглощенного митохондриями Ca2+ в пересчете на 1 мг белка.

Оценку трансмембранного потенциала (Δψ) изолированных митохондрий проводили на спектрофлуориметре «Shimadzu RF-5301-PC» с добавлением в среду инкубации катионного флуоресцентного красителя этилового эфира тетраметилродамина (tetramethylrhodamine ethyl ester, TMRE) при длинах волн поглощения 555 нм и излучения 577 нм [13]. После 20 минут инкубации митохондрий с TMRE, измеряли интенсивность флуоресценции. Затем в суспензию митохондрий добавляли 0,1 мкмоль разобщающего агента FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone), при этом наблюдалось падение флуоресценции. Величину трансмембранного потенциала (Δψ) оценивали по разнице интенсивности флуоресценции до и после добавления FCCP в пересчете на 1 мг белка митохондрий (Ед/мг).

Данные экспериментов представлены в виде среднего (М) и стандартной ошибки среднего (SEM). Достоверность различий между группами оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа. Критическим принимался уровень значимости р=0,05. Для статистической обработки данных использовали программу «Statistica 6.0».

Результаты и их обсуждение. Оценка кальций-связывающей способности и трансмембранного потенциала митохондрий миокарда показала отсутствие достоверных различий между интактными неадаптированными и адаптированными крысами (p>0,05; табл. 1, рис. 1)

Таблица 1. Кальций-связывающая способность митохондрий, изолированных из миокарда неадаптированных и адаптированных крыс (М±SEM)

Таблица 1. Кальций-связывающая способность митохондрий, изолированных из миокарда неадаптированных и адаптированных крыс (М±SEM)

Примечание: здесь и далее интактные - группа крыс с нормоксической перфузией изолированного сердца; ИР - группа крыс с моделированием ишемии и реперфузии изолированного сердца; + мтатистически значимые различия по сравнению с группой «Интактные» (р<0,05); * статистически значимые различия по сравнению с группой «Неадаптированные, ИР» (р<0,05); # статистически значимые различия по сравнению с группой «Адаптированные, ИР» (р<0,05); Количество особей в каждой группе составило 12.

Моделирование глобальной ишемии и реперфузии изолированного сердца вызывало снижение КСС митохондрий: у неадаптированных особей она уменьшалась на 39% по сравнению с исходным значением, тогда как у адаптированных животных - только на 13% (p<0,05; табл. 1). Это указывает на способность адаптации к ХНГ повышать устойчивость МРТ-пор митохондрий миокарда к открытию избытком ионов кальция при ишемии-реперфузии изолированного сердца у крыс. Известно, что реперфузионное повреждение миокарда сопровождается перегрузкой кардиомиоцитов ионами кальция [9]. МРТ-поры представляют собой каналы мембраны митохондрий, которые открываются в период реперфузии миокарда и способны пропускать ионы кальция, а также ряд белков и пептидов, размер которых не превышает 1,5 кДа [6]. Реперфузионное открытие МРТ-пор митохондрий способно запустить апоптоз или некроз клетки [6]. В связи с этим, оценка состояния МРТ-пор является важным показателем устойчивости кардиомиоцитов к ишемическому-реперфузионному повреждению.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что кардиальные опиоидные рецепторы принимают участие в регуляции устойчивости МРТ-пор миокардиальных митохондрий к действию ишемии-реперфузии в условиях адаптации к хронической непрерывной гипоксии [10]. Неселективная блокада всех типов кардиальных ОР налоксоном (300 нмоль/л) устраняла способность адаптации к ХНГ повышать устойчивость МРТ-пор к ишемии-реперфузии изолированного сердца у крыс [10]. Однако оставался нерешенным вопрос о том, какие именно субтипы кардиальных ОР способны оказывать регуляторное влияние на исследуемый показатель митохондрий.

Селективная блокада δ2-субтипа кардиальных ОР налтрибеном или µ-ОР пептидом CTAP устраняла защитное действие адаптации к хронической гипоксии - митохондрии, изолированные из миокарда адаптированных особей были способны накапливать достоверно меньше кальция, чем в группе сравнения (p<0,05; табл. 1). В случае селективной блокады δ1-ОР пептидом BNTX или κ-ОР норбиналторфимином за 10 минут до моделирования ишемии-реперфузии изолированного сердца у адаптированных крыс, кардиопротекторный эффект ХНГ сохранялся - кальций-связывающая способность митохондрий, выделенных из миокарда этих особей была такой же высокой, как и у адаптированных животных с незаблокированными кардиальными ОР (табл. 1). Перфузия изолированных сердец неадаптированных крыс селективными антагонистами ОР не влияла на кальций-связывающую способность митохондрий (таблица 1). Из этого следует, что в защитном эффекте хронической гипоксии, проявляющемся повышенной устойчивостью МРТ-пор митохондрий к открытию после моделирования ишемии и реперфузии, участвуют кардиальные δ2 и μ-опиоидные рецепторы.

Исследование трансмембранного потенциала митохондрий показало, что в ответ на моделирование ишемии и реперфузии изолированного сердца, значения Δψ снижаются как у неадаптированных крыс (в 2,3 раза по сравнению с группой интактных крыс, p<0,05; рис. 1), так и у адаптированных к гипоксии особей (в 1,2 раза по сравнению с группой интактных крыс, p>0,05; рис. 1). Однако после адаптации к ХНГ реперфузионное падение Δψ было незначительным (p>0,05; рис. 1).

Рис. 1. Трансмембранный потенциал митохондрий у неадаптированных и адаптированных крыс (Ед/мг белка). Интактные - группа крыс с нормоксической перфузией изолированного сердца; ИР - группа крыс с моделированием ишемии и реперфузии изолированного сердца.

Рис. 1. Трансмембранный потенциал митохондрий у неадаптированных и адаптированных крыс (Ед/мг белка). Интактные - группа крыс с нормоксической перфузией изолированного сердца; ИР - группа крыс с моделированием ишемии и реперфузии изолированного сердца.

Селективная блокада опиоидных рецепторов у неадаптированных крыс не влияла на постишемические значения трансмембранного потенциала митохондрий (рис. 1). У адаптированных к хронической гипоксии животных селективная блокада кардиальных δ2-ОР налтрибеном или µ-ОР пептидом CTAP устраняла защитное действие адаптации к ХНГ - митохондрии, изолированные из миокарда адаптированных особей демонстрировали меньшие значения Δψ, чем в группе сравнения (p<0,05; рисунок 1). Перфузия изолированных сердец антагонистом δ1-ОР пептидом BNTX или κ-ОР норбиналторфимином (norBNT) за 10 минут до моделирования ишемии-реперфузии у адаптированных крыс не влияла на проявление кардиопротекторного эффекта ХНГ - реперфузионные значения трансмембранного потенциала митохондрий оставались на таком же уровне, как и в группе сравнения (рис. 1). Следовательно, защитный эффект хронической непрерывной гипоксии, проявляющийся повышенной устойчивостью трансмембранного потенциала митохондрий после моделирования ишемии и реперфузии, связан с активацией кардиальных δ2 и μ-опиоидных рецепторов.

Полученные данные согласуются с результатами предыдущих работ, в которых продемонстрировано, что инфаркт-лимитирующий и цитопротекторный эффекты адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии также связаны с активацией δ2 и μ-опиоидных рецепторов [1; 11].

Заключение. Кардиальные δ2 и μ-опиоидные рецепторы принимают участие в повышении устойчивости МРТ-пор и трансмембранного потенциала митохондрий к ишемии-реперфузии изолированного сердца у крыс, адаптированных к хронической непрерывной гипоксии. δ1 и κ-субтипы кардиальных опиоидных рецепторов не принимают участия в реализации кардиопротекторного действия адаптации к хронической непрерывной гипоксии.

Список использованных источников:

1. Нарыжная Н.В., Маслов Л.Н., Цепокина А.В., Хуторная М.В., Кутихин А.Г., Нам И.Ф., Жанг И., Пей Ж.М. Значение опиоидных рецепторов в цитопротекторном действии хронической гипоксии при аноксии-реоксигенации кардиомиоцитов // Росс. физиол. жур. им. И.М. Сеченова. 2016. Т. 102, № 6. С. 688 - 697.

2. Argaud L., Gateau-Roesch O., Raisky O., Loufouat J., Robert D., Ovize M. Postconditioning inhibits mitochondrial permeability transition // Circulation. 2005. Vol. 111, № 2. P. 194-197.

3. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254.

4. Buzas B., Izenwasser S., Portoghese P.S., Cox B.M. Evidence for delta opioid receptor subtypes regulating adenylyl cyclase activity in rat brain // Life Sci. 1994. Vol. 54, № 7. P. PL101-PL106.

5. Gomez L., Paillard M., Thibault H., Derumeaux G., Ovize M. Inhibition of GSK3b by postconditioning is required to prevent opening of the mitochondrial permeability transition pore during reperfusion // Circulation. 2008. Vol. 117, № 21. P. 2761-2768.

6. Halestrap A.P. A pore way to die: the role of mitochondria in reperfusion injury and cardioprotection // Biochem. Soc. Trans. 2010. Vol. 38, № 4. P. 841-860.

7. Heijna M.H., Padt M., Hogenboom F., Portoghese P.S., Mulder A.H., Schoffelmeer A.N. Opioid receptor-mediated inhibition of dopamine and acetylcholine release from slices of rat nucleus accumbens, olfactory tubercule and frontal cortex // Eur. J. Pharmacol. 1990. Vol. 181, № 3. P. 267-278.

8. Hill-Pryor C., Lindsey D., Lapanowski K., Dunbar J.C. The cardiovascular responses to mu opioid agonist and antagonist in conscious normal and obese rats // Peptides. 2006. Vol. 27, № 6. P. 1520-1526.

9. Kleber G. The potential role of Ca2+ for electrical cell-to-cell uncoupling and conduction block in myocardial tissue // Basic Res. Cardiol. 1992. Vol. 87, Suppl 2. P.131-143.

10. Maslov L.N., Naryzhnaya N.V., Prokudina E.S., Kolar F., Gorbunov A.S., Zhang Y., Wang H., Tsibulnikov S.Yu., Portnichenko A.G., Lasukova T.V., Lishmanov Y.B. Preserved cardiac mitochondrial function and reduced ischemia/reperfusion injury afforded by chronic continuous hypoxia: Role of opioid receptors // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2015. Vol. 42, № 5. P. 496-501.

11. Maslov L.N., Naryzhnaya N.V., Tsibulnikov S.Yu., Kolar F., Zhang Y., Wang H., Gusakova A.M., Lishmanov Y.B. Role of endogenous opioid peptides in the infarct size-limiting effect of adaptation to chronic continuous hypoxia. // Life Sci. 2013. Vol. 93, № 9-11. P. 373-379.

12. Sanchez-Blazquez P., Rodriguez-Diaz M., Frejo M.T., Garzon J. Stimulation of mu- and delta-opioid receptors enchances phosphoinositide metabolism in mouse spinal cord: evidence for subtypes of delta-receptors // Eur. J. Neurosci. 1999. Vol. 11, № 6. P. 2059-2064.

13. Singh I.N., Sullivan P.G., Deng Y., Mbye L.H., Hall E.D. Time course of post-traumatic mitochondrial oxidative damage and dysfunction in a mouse model of focal traumatic brain injury: implications for neuroprotective therapy // J. Cereb. Blood Flow Metab. 2006. Vol. 26, № 11. P. 1407-1418.