Введение. Повышение устойчивости миокарда к ишемическому и реперфузионному повреждению, являющемуся центральным звеном патогенеза ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда, представляет важнейшую задачу экспериментальных и клинических исследований в медицине. Одним из эффективных методов, способных существенно повысить толерантность сердца к ишемии-реперфузии является адаптация к гипоксии [1, 11]. Ранее было продемонстрировано, что в сыворотке крови у адаптированных к хронической непрерывной гипоксии (ХНГ) животных повышается содержание эндогенных опиоидных пептидов [11]. Кроме того, в предыдущем исследовании удалось обнаружить, что в реализации кардиопротекторного эффекта адаптации к ХНГ принимают участие кардиальные опиоидные рецепторы [10]. При этом защитное действие адаптации к данному виду хронической гипоксии проявлялось увеличением устойчивости функций митохондрий к моделированию глобальной ишемии и реперфузии изолированного сердца у крыс [10]. Одним из важных показателей функциональной состоятельности миокардиальных митохондрий являются устойчивость МРТ-поры (mitochondrial transmembrane potential pore) и трансмембранного потенциала (Δψ) к ишемии-реперфузии. МРТ-пора представляет собой канал внутренней и внешней мембраны митохондрий, пропускающий некоторые ионы (например, ионы кальция), а также белки и пептиды размером до 1,5 кДа [6]. Устойчивость МРТ-пор к избытку ионов кальция во время реперфузии миокарда является важным показателем жизнеспособности кардиомиоцитов, поскольку открытие МРТ-поры способно запускать апоптоз или некроз [6]. Оставалось неясным, какие конкретно субтипы кардиальных опиоидных рецепторов принимают участие в реализации механизма кардиопротекции, а именно - способны повышать устойчивость МРТ-пор и трансмембранного потенциала митохондрий миокарда к действию ишемии и реперфузии.
Цель работы - исследовать участие δ1, δ2, μ и κ-кардиальных опиоидных рецепторов регуляции устойчивости функций митохондрий миокарда к действию глобальной ишемии и реперфузии изолированного сердца у крыс, адаптированных к хронической непрерывной гипоксии.
Материалы и методы исследования.
Эксперименты проведены на крысах-самцах линии Вистар массой 250-300 г. Исследование выполнялось в соответствии с рекомендациями, изложенными в Приказе МЗ СССР за № 755 от 12 августа 1977 г., а также принятыми в Хельсинской декларации 1975 г. и дополненными в 1983 г. Исследования были одобрены этическим комитетом НИИ кардиологии. Все болезненные процедуры осуществляли на наркотизированных эфиром животных. Количество особей в каждой группе составило 12. Крыс адаптировали в гипоксической камере к хронической непрерывной гипоксии в течение 21 суток при 12% содержании кислорода и нормальном атмосферном давлении [11]. Газовый состав дыхательной смеси контролировался с помощью датчиков TCOD-IR и OLC 20 (Oldham, Франция) и аппарата «Био-нова-204G4R1» (НТО «Био-нова», Москва) через блок управления МХ 32 (Oldham, Франция). За 24 часа до начала эксперимента адаптированных крыс извлекали из гипоксической камеры. Крысы неадаптированных групп содержались в стандартных условиях вивария при постоянном доступе к воде и корму. На изолированном сердце у крыс моделировали глобальную 45-минутная ишемию и 30-минутную реперфузию. Сердца интактных особей перфузировали в течение 95 минут (интактные). С целью оценки участия кардиальных δ1, δ2, μ и κ-опиоидных рецепторов (ОР) в реализации защитного эффекта ХНГ за 10 минут до глобальной ишемии изолированные сердца крыс перфузировали растворами селективных антагонистов ОР: селективный антагонист δ1-ОР BNTX (1 нмоль/л) [12]; селективный антагонист δ2-ОР налтрибен (1 нмоль/л) [4]; селективный антагонист µ-ОР CTAP (100 нмоль/л) [8]; селективный антагонист κ-ОР норбиналторфимин (norBNT) (3 нмоль/л) [7].
Из миокарда левого желудочка митохондрии изолировали методом дифференциального центрифугирования в сахарозном буфере [2]. Миокард гомогенизировали в растворе, содержащем 70 ммоль сахарозы, 210 ммоль маннитола, 6 ммоль EGTA, 10 ммоль HEPES и 5 мг/мл БСА (бычий сывороточный альбумин), рН 7,38. Полученный гомогенат центрифугировали 10 минут при 900 g. Надосадочную жидкость центрифугировали 10 минут при 12000 g. Осадок, содержащий митохондрии, ресуспендировали в буфере без БСА, затем центрифугировали 10 минут при 12000 g. Осадок, содержащий митохондрии, ресуспендировали в изоляционном буфере без EGTA и БСА. Содержание белка в суспензии митохондрий определяли по методу Брэдфорд [3].
Устойчивость МРТ-пор к ишемии-реперфузии оценивали по способности изолированных миокардиальных митохондрий поглощать и удерживать ионы кальция (кальций-связывающая способность, КСС, нмоль CaCl2/мг белка митохондрий). Кальций-связывающую способность митохондрий измеряли на спектрофлуориметре «Shimadzu RF-5301-PC» с использованием кальций-чувствительного флуоресцентного зонда Calcium Green 5N (Invitrogen, Molecular Probes Inc.) при длинах волн поглощения 506 нм и излучения 532 нм [5]. К суспензии митохондрий добавляли дробно по 100 нмоль хлорида кальция до тех пор, пока МРТ-пора не открывалась, что регистрировалось как максимальное возрастание флуоресценции. КСС рассчитывали по количеству поглощенного митохондриями Ca2+ в пересчете на 1 мг белка.
Оценку трансмембранного потенциала (Δψ) изолированных митохондрий проводили на спектрофлуориметре «Shimadzu RF-5301-PC» с добавлением в среду инкубации катионного флуоресцентного красителя этилового эфира тетраметилродамина (tetramethylrhodamine ethyl ester, TMRE) при длинах волн поглощения 555 нм и излучения 577 нм [13]. После 20 минут инкубации митохондрий с TMRE, измеряли интенсивность флуоресценции. Затем в суспензию митохондрий добавляли 0,1 мкмоль разобщающего агента FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone), при этом наблюдалось падение флуоресценции. Величину трансмембранного потенциала (Δψ) оценивали по разнице интенсивности флуоресценции до и после добавления FCCP в пересчете на 1 мг белка митохондрий (Ед/мг).
Данные экспериментов представлены в виде среднего (М) и стандартной ошибки среднего (SEM). Достоверность различий между группами оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа. Критическим принимался уровень значимости р=0,05. Для статистической обработки данных использовали программу «Statistica 6.0».
Результаты и их обсуждение. Оценка кальций-связывающей способности и трансмембранного потенциала митохондрий миокарда показала отсутствие достоверных различий между интактными неадаптированными и адаптированными крысами (p>0,05; табл. 1, рис. 1)
Таблица 1. Кальций-связывающая способность митохондрий, изолированных из миокарда неадаптированных и адаптированных крыс (М±SEM)
Примечание: здесь и далее интактные - группа крыс с нормоксической перфузией изолированного сердца; ИР - группа крыс с моделированием ишемии и реперфузии изолированного сердца; + мтатистически значимые различия по сравнению с группой «Интактные» (р<0,05); * статистически значимые различия по сравнению с группой «Неадаптированные, ИР» (р<0,05); # статистически значимые различия по сравнению с группой «Адаптированные, ИР» (р<0,05); Количество особей в каждой группе составило 12.
Моделирование глобальной ишемии и реперфузии изолированного сердца вызывало снижение КСС митохондрий: у неадаптированных особей она уменьшалась на 39% по сравнению с исходным значением, тогда как у адаптированных животных - только на 13% (p<0,05; табл. 1). Это указывает на способность адаптации к ХНГ повышать устойчивость МРТ-пор митохондрий миокарда к открытию избытком ионов кальция при ишемии-реперфузии изолированного сердца у крыс. Известно, что реперфузионное повреждение миокарда сопровождается перегрузкой кардиомиоцитов ионами кальция [9]. МРТ-поры представляют собой каналы мембраны митохондрий, которые открываются в период реперфузии миокарда и способны пропускать ионы кальция, а также ряд белков и пептидов, размер которых не превышает 1,5 кДа [6]. Реперфузионное открытие МРТ-пор митохондрий способно запустить апоптоз или некроз клетки [6]. В связи с этим, оценка состояния МРТ-пор является важным показателем устойчивости кардиомиоцитов к ишемическому-реперфузионному повреждению.
Ранее в нашей лаборатории было показано, что кардиальные опиоидные рецепторы принимают участие в регуляции устойчивости МРТ-пор миокардиальных митохондрий к действию ишемии-реперфузии в условиях адаптации к хронической непрерывной гипоксии [10]. Неселективная блокада всех типов кардиальных ОР налоксоном (300 нмоль/л) устраняла способность адаптации к ХНГ повышать устойчивость МРТ-пор к ишемии-реперфузии изолированного сердца у крыс [10]. Однако оставался нерешенным вопрос о том, какие именно субтипы кардиальных ОР способны оказывать регуляторное влияние на исследуемый показатель митохондрий.
Селективная блокада δ2-субтипа кардиальных ОР налтрибеном или µ-ОР пептидом CTAP устраняла защитное действие адаптации к хронической гипоксии - митохондрии, изолированные из миокарда адаптированных особей были способны накапливать достоверно меньше кальция, чем в группе сравнения (p<0,05; табл. 1). В случае селективной блокады δ1-ОР пептидом BNTX или κ-ОР норбиналторфимином за 10 минут до моделирования ишемии-реперфузии изолированного сердца у адаптированных крыс, кардиопротекторный эффект ХНГ сохранялся - кальций-связывающая способность митохондрий, выделенных из миокарда этих особей была такой же высокой, как и у адаптированных животных с незаблокированными кардиальными ОР (табл. 1). Перфузия изолированных сердец неадаптированных крыс селективными антагонистами ОР не влияла на кальций-связывающую способность митохондрий (таблица 1). Из этого следует, что в защитном эффекте хронической гипоксии, проявляющемся повышенной устойчивостью МРТ-пор митохондрий к открытию после моделирования ишемии и реперфузии, участвуют кардиальные δ2 и μ-опиоидные рецепторы.
Исследование трансмембранного потенциала митохондрий показало, что в ответ на моделирование ишемии и реперфузии изолированного сердца, значения Δψ снижаются как у неадаптированных крыс (в 2,3 раза по сравнению с группой интактных крыс, p<0,05; рис. 1), так и у адаптированных к гипоксии особей (в 1,2 раза по сравнению с группой интактных крыс, p>0,05; рис. 1). Однако после адаптации к ХНГ реперфузионное падение Δψ было незначительным (p>0,05; рис. 1).
Рис. 1. Трансмембранный потенциал митохондрий у неадаптированных и адаптированных крыс (Ед/мг белка). Интактные - группа крыс с нормоксической перфузией изолированного сердца; ИР - группа крыс с моделированием ишемии и реперфузии изолированного сердца.
Селективная блокада опиоидных рецепторов у неадаптированных крыс не влияла на постишемические значения трансмембранного потенциала митохондрий (рис. 1). У адаптированных к хронической гипоксии животных селективная блокада кардиальных δ2-ОР налтрибеном или µ-ОР пептидом CTAP устраняла защитное действие адаптации к ХНГ - митохондрии, изолированные из миокарда адаптированных особей демонстрировали меньшие значения Δψ, чем в группе сравнения (p<0,05; рисунок 1). Перфузия изолированных сердец антагонистом δ1-ОР пептидом BNTX или κ-ОР норбиналторфимином (norBNT) за 10 минут до моделирования ишемии-реперфузии у адаптированных крыс не влияла на проявление кардиопротекторного эффекта ХНГ - реперфузионные значения трансмембранного потенциала митохондрий оставались на таком же уровне, как и в группе сравнения (рис. 1). Следовательно, защитный эффект хронической непрерывной гипоксии, проявляющийся повышенной устойчивостью трансмембранного потенциала митохондрий после моделирования ишемии и реперфузии, связан с активацией кардиальных δ2 и μ-опиоидных рецепторов.
Полученные данные согласуются с результатами предыдущих работ, в которых продемонстрировано, что инфаркт-лимитирующий и цитопротекторный эффекты адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии также связаны с активацией δ2 и μ-опиоидных рецепторов [1; 11].
Заключение. Кардиальные δ2 и μ-опиоидные рецепторы принимают участие в повышении устойчивости МРТ-пор и трансмембранного потенциала митохондрий к ишемии-реперфузии изолированного сердца у крыс, адаптированных к хронической непрерывной гипоксии. δ1 и κ-субтипы кардиальных опиоидных рецепторов не принимают участия в реализации кардиопротекторного действия адаптации к хронической непрерывной гипоксии.