Алкогольная болезнь является значимой медико-социальной проблемой, что связано с широким распространением заболевания, тяжестью поражения различных органов и систем, трудностями в лечении и реабилитации. В России в настоящее время насчитывается около 8 млн. человек с установленным диагнозом хронического алкоголизма. В условиях хронической алкогольной интоксикации происходит патологическая перестройка метаболизма, приводящая к глубоким структурно-функциональным нарушениям в органах и системах, сопровождающаяся первоначальной перестройкой обменных процессов с последующей декомпенсацией защитных и регуляторных систем организма [5]. Изучение последовательности процессов порождаемых патологическим воздействием этанола на организм, позволяет выявить структурно-функциональные нарушения, вызванные таким взаимодействием ведущие к необратимым изменениям функции систем жизнедеятельности организма.
Среди множества причин, вызывающих изменение нормального гомеостаза, одно из главных мест принадлежит эндогенной интоксикации (ЭИ). Под ЭИ понимают состояние, обусловленное деструктивными процессами в результате которых в жидкостях и тканях организма накапливаются промежуточные и конечные продукты нормального обмена веществ, а также продукты нарушенного метаболизма соединительной ткани, компоненты деградации ее нормальных структур, продукты жизнедеятельности бактерий и антигены, в нефизиологических концентрациях оказывающие токсическое влияние и вызывающие дисфункцию различных органов и систем [9, 10]. Особое место в структуре ЭИ занимает дисфункция микробиоценозов в тех или иных биотопах человеческого организма [11].
Алкоголь способен существенно изменить количественный и качественный состав микрофлоры кишечника. Этот факт неоднократно был продемонстрирован в различных исследованиях. Например, J.C. Bode и соавт. показали, что почти у половины больных алкоголизмом в аспирате тощей кишки обнаружено увеличение общего числа бактерий с преобладанием анаэробных микроорганизмов [13]. Подобная картина была выявлена у пациентов с алкогольным циррозом печени. Аналогичные результаты получены T. Hauge и соавт., обнаружившими избыточный рост бактерий в двенадцатиперстной кишке больных алкоголизмом [16]. Наличие синдрома избыточного бактериального роста (СИБР) описано также в экспериментальных моделях алкогольной болезни печени (АБП) [18]. Алкоголь приводит к избыточному бактериальному росту в тонком кишечнике с преобладанием анаэробных микроорганизмов. В условиях интенсивного роста бактерии начинают усиленно метаболизировать этанол, в результате чего, как в просвете кишечника, так и в портальном кровотоке повышается концентрация ацетальдегида [12,13]. Ацетальдегид воздействует на белки плотного и адгезионного контакта, которые сохраняют целостность кишечной стенки и препятствуют проникновению макромолекул через эпителиальный слой. Влияние ацетальдегида на кишечную проницаемость является дозозависимым и на развитие эффектов влияет, в числе прочих факторов, состояние микробиоты кишечника [1, 15]. Нарушение проницаемости кишечной стенки, в свою очередь, способствует проникновению бактериальных эндотоксинов в плазму крови, что играет существенную роль в формировании ЭИ [4, 11].
Цель: оценить изменения микрофлоры кишечника и содержание провоспалительных цитокинов в плазме крови крыс при моделировании хронической алкогольной интоксикации.
Материалы и методы. Исследование проводилось в лаборатории психофармакологии НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета (ВолгГМУ), анализ собранного материала проводился на кафедре клинической лабораторной диагностики ФУВ ВолгГМУ и в лаборатории геномных и протеомных исследований Волгоградского медицинского научного центра (ВМНЦ).
Для моделирования токсического полиорганного поражения при длительной (хронической) алкогольной интоксикации использовали методы искусственной полидипсии с 15% этанолом [3, 7]. Исследование было выполнено на 40 крысах-самцах линии Wistar массой 180-250 г. Животные были разделены на 2 группы: контрольная группа - 20, экспериментальная - 20. Контрольные группы содержались в стандартных условиях с постоянным доступом к чистой воде. Все манипуляции с животными соответствовали требованиям международных правил гуманного отношения к животным, используемых в экспериментах. Животным экспериментальной группы давали 15% раствор этанола в качестве единственного источника жидкости на протяжении 40 суток [2].
Оценка состояния микрофлоры кишечника крыс производилась до начала эксперимента (по истечению срока карантина) и на 40-е сутки. Фекалии собирали непосредственно из прямой кишки в стерильный контейнер методом массирования кишечника для исключения попадания сторонней микрофлоры и мочевых осадков в образец. Микрофлора кишечника оценивалась методом бактериологического посева по стандартным методикам. В качестве объектов микробиологического исследования были выбраны Bifidobacterium spp., Lactobacterium spp., Escherichia coli, Escherichia coli hemolizating, Enteroccocus spp., Candida spp., Proteus spp. и Staphylococcus spp.
Кровь для биохимических исследований отбиралась из нижней полой вены, плазму отделяли центрифугированием. Определение уровня цитокинов (IL-1β, IL-6 и ФНО-α) в плазме крови проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА). Учёт результатов проводили при помощи микропланшетного спектрофотометра iMark Bio-Rad (США). Определение активности ферментов: лактатдегидрогеназа (ЛДГ), аспартатаминотрансфераза (АсАТ), аланинаминотрансфераза (АлАТ) в плазме крови проводили стандартными биохимическими методами с использованием реагентов «Диакон-ДС» (Россия).
Статистическую обработку данных производили в программе GraphPad Prism 5.0. Распределение данных оценивали по критерию Шапиро-Уилка, при нормальном распределении применяли критерий Стьюдента, при распределении, отличающемся от нормального, использовали критерий Манна-Уитни.
Результаты и их обсуждение. При анализе результатов микробиологического исследования в составе микробной флоры у животных экспериментальной группы было выявлено сокращение сахаролитической микрофлоры - Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. на 2-4 порядка (рис. 1).
Рис. 1. Динамика сахаролитической микрофлоры (Bifidobacterium spp., Lactobacterium spp.) в фекалиях крыс при моделировании хронической 40-дневной алкоголизации.
По результатам оценки состава протеолитической микрофлоры также был выявлен ряд изменений. В опытной группе по сравнению с контрольной наблюдалось повышение Enteroccocus spp., Staphylococcus spp. на 3-4 порядка (рис. 2). Более выраженная тенденция увеличения титра (1∙107-1∙106 колониеобразующие единицы (КОЕ)) прослеживалась у гемолизирующей Escherichia coli.
Отмечалось появление типичных представителей дисбиотических процессов - Candida spp. и Proteus spp. Случаи повышения высеваемости в опытной группе Candida spp. и Proteus spp. составили 1,2∙102 КОЕ и 1,1∙102-1,3∙101 соответственно.
Рис. 2. Динамика нормальных представителей протеолитической микрофлоры (Enteroccocus spp., Staphylococcus spp., Escherichia coli hemolizating) в фекалиях крыс при моделировании хронической 40-дневной алкоголизации.
В ходе микробиологического исследования было установлено, что под влиянием алкоголя равновесие сместилось в сторону грамотрицательных протеобактерий, являющихся источником эндотоксинов. Известно, что эндотоксины, наряду с этанолом, приводят к активации как печеночных (клетки Купфера), так и внепеченочных макрофагов и продукции провоспалительных цитокинов, таких как ФНО-α, IL-1β, IL-6 [12, 15].
Рис. 3. Динамика уровня IL-1β, IL-6, ФНО-α плазмы крови у крыс при моделировании хронической алкоголизации.
Рис. 4. Динамика активности АлАТ, АсАТ, ЛДГ у крыс при моделировании хронической алкоголизации.
Установлено, что хроническая алкогольная интоксикация приводит к нарушению цитокинового профиля. У животных экспериментальной группы содержание IL-1β в плазме крови достоверно (p<0,001, критерий Манна-Уитни) увеличилось более чем в 2 раза по сравнению с контрольными животными группы (рис. 3). Более того, эти изменения сопровождались статистически значимым повышением плазменных концентраций IL-6 (p<0,01, критерий Манна-Уитни) и ФНОα (p<0,05, критерий Манна-Уитни), что говорит о развитии воспалительных процессов, сопровождающих эндогенную интоксикацию [8].
АлАТ является биохимическим признаком поражения печени, однако в условиях стресса и сопутствующего им повышения синтеза глюкокортикоидов, синтез АлАТ может резко увеличиваться, что связано с необходимостью активации глюконеогенеза из-за устойчивой потребности организма в энергетически ценных субстратах. Известно, что при алкоголизме также может наблюдаться увеличение уровня глюкокортикоидов в плазме [6]. В нашей работе было отмечено статистически значимое увеличение активности аминотрансфераз (p<0,001, критерий Стьюдента, рис. 4), которое сопровождалось значимым (p<0,05, критерий Стьюдента) увеличением активности ЛДГ. Обнаруженные изменения могут быть объяснены тем, что при воспалительных поражениях печени поддержание уровня глюкозы в крови за счёт гликогенолиза может нарушаться, что обусловливает увеличение распада эндогенных белков и последующее вовлечение гликогенных аминокислот при помощи трансаминаз в глюконеогенез, необходимый для поддержания гликемии.
Выводы
- Установлено, что алкоголь может быть одним из основных факторов, влияющих на качественный и количественный состав микрофлоры кишечника. Изменения таксономического состава микрофлоры при хронической алкогольной интоксикации заключается в активном росте типичных представителей дисбиотических процессов, таких как, Candida spp. и Proteus spp., являющихся источником эндотоксинов.
- Эндотоксины, вырабатываемые бактериями в результате изменения колонизационной резистентности кишечника, активизируют печеночные макрофаги и приводят к продукции провоспалительных цитокинов - IL-1β, IL-6, ФНО-α.
- Установлено, что хроническая алкогольная интоксикация сопровождается увеличением активности в плазме крови АлАТ, АсАТ, ЛДГ, отражающих поражение печени вследствие эндогенной интоксикации.