Введение. Первичный акцент ставится на математических и статистических методах, которые используются для метаболического профилирования в биохимии [2, 10]. Развитие статистических методологий, таких как полиномиальная регрессия, делает возможным описание метаболических процессов у всех групп пациентов [13, 14].
Важнейшей технически трудной задачей остается идентификация и определение концентраций молекул в живой клетке, поскольку прогресс в системном, клеточном и молекулярном понимании зависит от знания клеточного метаболизма и протеома [9].
Уравнения математической биологии представляют иерархию моделей различной сложности. Они описывают различные стадии динамических процессов и пригодны для аналитического изучения варьирующих переменных [3].
Математические модели, обычно типичные, либо дифференциальные уравнения, предоставляют возможность углубленного понимания биологических систем.
Метаболиты - объект исследования метаболомики, являющиеся конечными продуктами клеточных регуляторных процессов, и их уровни могут рассматриваться как ответы биологической системы на генетические изменения и на влияние окружающей среды. Фундаментальной задачей метаболомики (метаболического анализа) является быстрая и точная идентификация метаболитов, определяемых в сложном биологическом образце и установление изменений в ответ на экспериментальные условия (состояние по заболеванию, лекарственная терапия и др.). Математическое моделирование предлагает улучшенные возможности для создания общих прогнозов, новых гипотез для лучшего понимания сложных биологических систем [11].
Математические модели необходимы для интерпретации результатов метаболомических исследований, приводя к обнаружению новых биохимических маркеров и современному пониманию основных биохимических процессов [6].
Понятие биохимического профиля организма включает в себя совокупность индивидуальных показателей протекания биологических реакций, обеспечивающих основы жизнедеятельности и уровень ответа на воздействие экзогенных и эндогенных факторов [12].
Молекулы средней массы являются универсальным биохимическим маркером наличия эндогенной интоксикации и патологических состояний в организме. Понимание их природы именно как метаболитов, метаболомический подход к их идентификации, был предложен М.Я. Малаховой [5, 8].
Одним из наиболее удобных и чувствительных показателей, характеризующих механизмы эндогенной интоксикации, является связывающая способность молекулы альбумина. Альбумин принимает участие в элиминации эндотоксинов и является частью одной из систем биотрансформации организма. Связывающая способность альбумина может быть важным метаболическим маркером патологических состояний организма [4,7].
Целью нашего исследования является изучение биохимических метаболических изменений в некоторых биологических жидкостях у детей с ВЗК с применением методов статистического моделирования.
Материалы и методы. Материал исследования - плазма и эритроциты крови, а также образцы мочи 103 детей с воспалительными заболеваниями кишечника (62 ребенка с неспецифическим язвенным колитом и 41 ребенок с болезнью Крона). Контрольную группу составили 36 практически здоровых детей. Кровь и мочу для исследования брали утром, натощак. Определение общего уровня молекул средней массы крови и мочи проводили по методу М.Я. Малаховой, связывающей способности альбумина - по методу Добрецова и Миллера при помощи флуоресцентного зонда K-35. Отдельные пулы и составляющие общего спектра МСМ рассчитывались по М.Я. Малаховой и по оригинальному методу.
Обработка материала исследования: статистическая обработка проводилась общепринятыми методами с использованием пакета программ STATISTICA 8,0; нормальность признаков оценивалась по методу Шапиро-Уилкса, корреляционные взаимосвязи внутри групп больных рассчитывались по методу Спирмена и Стьюдента, для сравнения групп в случае гауссова распределения использовался t-критерий, при его отсутствии применялся непараметрический критерий Колмогорова-Смирнова, факторный анализ проводился по методу принципиальных компонент, для оценки математических взаимосвязей между показателями строились регрессионные модели полиноминальной регрессии.
Результаты и их обсуждение. Суммарный уровень МСМ был исследован в плазме, эритроцитах крови и в моче в общей группе детей с воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК): при неспецифическом язвенном колите (НЯК) и в группе детей, страдающих болезнью Крона, а также в контрольной группе. Достоверные отличия по значениям общего пула МСМ плазмы, эритроцитов и мочи со значительным их повышением в жидких средах были обнаружены для общей группы детей с ВЗК по сравнению с контрольной группой (табл. 1). Критерий Колмогорова-Смирнова показал также существенные различия в уровне МСМ эритроцитов для этих двух групп (табл. 1).
Таблица 1. Общий пул МСМ в норме и при ВЗК
С целью выявления различий в группах детей, больных НЯК и болезнью Крона, проводилось сравнение уровня МСМ с контрольной группой и между больными детьми. В группе детей с НЯК, как и в группе детей с болезнью Крона, отмечены достоверно повышенные относительно контроля показатели МСМ плазмы и мочи, а также статистически достоверные различия в уровне МСМ эритроцитов (табл. 1). Отмеченный повышенный уровень токсичности плазмы позволяет предположить наличие эндотоксемии у детей с ВЗК, при этом полученные различия в значении МСМ эритроцитов свидетельствуют о вовлеченности эритроцитов в формирование этого патологического процесса. Тот факт, что различия по показателю МСМ эритроцитов получены методом непараметрической статистики подчеркивает, что эти изменения носят глубинный характер, и возможно, отражают первичную стадию вовлечения эритроцитов в процессы адсорбции МСМ на их гликокаликсе, то есть о перераспределении МСМ в крови между белками плазмы и эритроцитами. Эритроциты способны сорбировать значительное количество токсических веществ и снижать уровень МСМ в плазме, что определяет их роль в компенсаторной фазе эндогенной интоксикации.
Уровень МСМ мочи во всех изученных группах, хоть и находился в пределах нормальных значений, приближался к верхней границе нормы и был достоверно выше контрольных значений, что свидетельствует о повышенном выводе МСМ с мочой и достаточной компенсаторной функции почек.
При сравнении групп детей с НЯК и болезнью Крона никаких достоверных отличий не получено.
В пределах общего пула МСМ диагностическую значимость имеет его часть, называемая катаболической (или катаболическим пулом) регистрируемая в интервале 238-258 нм. В ее составе обнаруживаются продукты белкового катаболизма, имеющие выраженный мембранотоксический потенциал, в частности, мочевина, креатинин и мочевая кислота. В интервале 266-298 нм регистрируется протеолитическая часть, анаболический пул, представляющий собой совокупность продуктов протеолиза белков.
При исследовании этих пулов в плазме и эритроцитах крови больных детей, а также в контрольной группе, отмечено достоверное повышение значений катаболического и анаболического пулов плазмы (КПП и АПП соответственно) общей группы детей с ВЗК по сравнению с контрольной группой, а также в группах детей с НЯК и болезнью Крона по сравнению с контролем (табл. 2). Кроме того, для всех трех групп больных детей найдены достоверные различия для значений катаболического и анаболического пула эритроцитов (КПЭ и АПЭ соответственно) (табл. 2). При сравнении групп детей с НЯК и болезнью Крона никаких достоверных отличий не получено. Выявленное увеличение в плазме продуктов белкового катаболизма описано в литературе как маркер, указывающий на резкое нарастание тяжести интоксикации метаболитами. Увеличение уровня продуктов протеолиза свидетельствует о глубоких метаболических изменениях. Отсутствие каких-либо отличий от нормы для эритроцитов, при доказанном участии их в формировании метаболической интоксикации, говорит о том, что возможные изменения эритроцитов находятся пока еще на первичном этапе.
Таблица 2. Пулы МСМ плазмы и эритроцитов в норме и при ВЗК
Целью метаболического профилирования является, в частности, идентификация различных метаболитов по их спектрам поглощения. Рассмотрение МСМ с позиций метаболомики, начатое М.Я. Малаховой, нуждается в дополнении современными данными и новой интерпретации. В пределах общего пула МСМ по максимумам их поглощения уже установлены некоторые метаболиты. В частности, были выделены катаболическая составляющая общего пула МСМ, полученная при длине волны 242-246 нм (регистрируются в первую очередь продуктов белкового катаболизма – креатинин, мочевина, мочевая кислота); а также протеолитическая составляющая, определяемая при длине волны 278-282 нм, (регистрируются в первую очередь ароматические аминокислоты).
При исследовании катаболической составляющей плазмы (КСП) и протеолитической составляющей плазмы (ПСП) в общей группе детей с ВЗК, а также в группах детей с НЯК и болезнью Крона, найдено достоверное повышение этих показателей относительно контрольной группы (табл. 3). Что касается эритроцитов, то при проведении сравнений непараметрическим методом (вследствие наличия негауссова распределения), получены достоверные отличия для показателя катаболической составляющей эритроцитов (КСЭ) в общей группе детей с ВЗК и в группе детей с НЯК, но не с болезнью Крона (табл. 3). Для протеолитической составляющей эритроцитов (ПСЭ) отличий е найдено.
При сравнении групп детей с НЯК и болезнью Крона никаких достоверных отличий не получено.
Таблица 3. Показатели составляющих пулов МСМ плазмы и эритроцитов в норме и при ВЗК
Таким образом, при ВЗК в составе катаболического пула плазмы наблюдается повышение продуктов пуринового обмена, мочевой кислоты, в частности, а также увеличение уровня белковых фрагментов, в частности ароматических аминокислот. В эритроцитах обнаружено отличие от нормы по уровню ароматических аминокислот. Следовательно, эритроциты вовлечены в процесс формирования интоксикационного синдрома при НЯК в большей степени, чем при болезни Крона, и это может отражать как тяжесть течения заболевания, так и возможность использования эритроцита в качестве модели для изучения его патогенеза.
Поскольку нарушений работы почек у детей с ВЗК не было выявлено, хотя и был установлен достоверно повышенный относительно контроля вывод МСМ с мочой, представлялось интересными изучить одну из систем биотрансформации эндотоксинов, а именно, систему биотрансформации молекулы альбумина, при данных заболеваниях и метаболической интоксикации. Для этого оценивалась общая концентрация альбумина (ОКА), эффективная концентрация альбумина (ОКА) и оценивался резерв связывающей способности альбумина (РСА), отражающий способность конформационных центров молекулы связывать эндотоксины с целью их дальнейшей элиминации.
Во всех изучаемых группах больных детей установлено достоверное снижение относительно контрольной группы всех этих показателей, что говорит, во-первых о снижении самого общего уровня альбумина в крови детей с ВЗК, во-вторых, о снижении количества конформационных центров, способных связывать различные биологические молекулы, в том числе эндотоксинов, и в-третьих, о нарушении самого процесса биотрансформации на уровне молекулы альбумина (рис. 1).
Рис. 1. Показатели молекулы альбумина в норме и при ВЗК.
Современные методы интерпретации и оценки полученных данных невозможны без применения инструментов системной и компьютерной биологии. Построение математических и статистических моделей является важным и неотъемлемым этапом этой интерпретации. С точки зрения метаболомики представляется интересным изучить взаимосвязи процесса формирования и накопления метаболитов в плазме, эритроцитах, и процесса их элиминации как на уровне почек так и на уровне системы биотрансформации альбумина. Кроме того, представляется необходимым найти математические подтверждения вовлечения эритроцита и его мембраны как в процессы накопления метаболитов, так и в патогенез ВЗК.
С этой целью в общей группе детей с ВЗК проводился анализ корреляционных взаимосвязей, который показал наличие корреляции (от слабой до средней степени) между процессами накопления метаболитов в плазме, эритроцитах и элиминации их с мочой с одной стороны, и накоплением эндотоксинов в плазме и эритроцитах с другой.
Проведенный в общей группе детей с ВЗК факторный анализ (анализ главных компонент) показал группирование всех изученных показателей в четыре основных фактора: эритроцитов, плазмы, молекулы альбумина и мочи.
Фактор 1 - фактор эритроцитов - составили показатели КПЭ, АПЭ, МСМ эритроцитов, КСЭ и ПСЭ.
Фактор 2 – фактор плазмы - составили показатели КПП и КСП.
Фактор 3 – фактор альбумина - составили показатели ЭКА и ОКА.
Фактор 4 - фактор мочи – составил показатель МСМ мочи.
Исходя из полученных результатов как корреляционного, так и факторного анализа, были построены регрессионные модели полиноминальной регрессии для МСМ эритроцитов, с целью установления степени вовлеченности эритроцитов в патологические процессы при ВЗК. Получено следующее уравнение регрессии:
Из уравнения следует, что существуют тесные числовые взаимосвязи между процессами накопления эндотоксинов в плазме и эритроцитах. Если статистический анализ показывает лишь корреляционные взаимосвязи, то уравнение регрессии устанавливает числовые зависимости исследуемых параметров, то есть выражает их математическую зависимость. Путем подстановки полученных опытных значений этих параметров в рабочую регрессионную модель, можно, решив уравнение, найти численное значение любого интересующего показателя.
Заключение. Установлена необходимость дальнейшего более полного изучения МСМ с позиций метаболомики и применением новейших современных методов хроматографии и масс-спектрометрии с целью точного установления всех веществ, входящих в состав пула МСМ.
Использование метаболического профилирования позволило выявить роль эритроцитов в патогенезе ВЗК, формирование интоксикации и доказать связь процессов накопления МСМ в плазме и эритроцитах, а также серьезных нарушений процесса биотрансформации метаболитов на уровне молекулы альбумина.
Представляется необходимым дальнейшее изучение функционального состояния мембран эритроцитов и связи нарушений этого состояния с метаболическими изменениями, происходящими в организме детей с ВЗК по мере прогрессирования заболевания. Это даст возможность изучения важных звеньев патогенеза этих тяжелых патологических состояний и поиска критериев для прогнозирования их течения.