Введение. Диагностика и терапия внебольничной пневмонии в детском возрасте являются актуальными вопросами педиатрии в связи с достаточно высокой заболеваемостью и сохраняющейся смертностью [1]. Причем, в 5–15% всех внебольничных пневмоний причиной их развития являются вирусные инфекции, основное значение среди которых имеет вирус гриппа [5]. В настоящее время при гриппе принято выделять три формы пневмонии: первичная вирусная пневмония, вторичная вирусно–бактериальная и третичная пневмония. При этом следует отметить, что в детском возрасте при гриппе чаще встречается вторичная вирусно-бактериальная пневмония, ассоциированная с разнообразным спектром микроорганизмов (S.pneumoniae, H.influen-zae типа b и пр.) и обуславливающая высокий процент неблагоприятных исходов. Тяжелые внебольничные пневмонии у детей нередко сопровождаются синдромом системной воспалительной реакции (ССВР), сепсисом и полиорганной недостаточностью, которые представляют стадии развития одного процесса. В генезе развития ССВР наиболее важным звеном считают гиперпродукцию провоспалительных цитокинов и оксида азота (NO), как основного повреждающего фактора эндотелия капилляров и обуславливающего формирование дисфункции эндотелия [2]. Кроме оксида азота, одним из изученных маркеров, характеризующих дисфункцию эндотелия, является эндотелин-1.
В норме уровень эндотелина чрезвычайно низкий, однако под воздействием различных факторов (гипоксия, ишемия, стресс) стимулируется его синтез. Известно, что эндотелин оказывает мощное вазоконстрикторное действие, может способствовать внутрисосудистому свертыванию крови [3]. Регуляторное действие оксида азота в организме обеспечивается его генерацией из L-аргинина, катализируемой изоформами NO-синтаз (NOS) [7]. Показано, что физиологические концентрации NO играют важную роль в регуляции функций иммунной системы, эндотелия сосудов, нейротрансмиссии, поддержании гемостаза. В тоже время, недостаток, как и избыток NO могут вызывать ряд патологических состояний (тромбообразование, ишемию органов, дисбаланс регуляторных систем) [4]. Представляется вероятным, что активность определенных изоформ NOS, являющихся продуктами экспрессии соответствующих генов (NOS1-3), может обеспечивать различную концентрацию NO в организме, и таким образом, определять его функцию как физиологического регулятора, либо как токсического агента. А повышение концентрации эндотелина у пациентов с мутациями в соответствующем гене, может стать значимым в развитии и усугублении дисфункции эндотелия.
Поэтому поиск генетических критериев, характеризующих дисфункцию эндотелия при гриппе, осложненном пневмонией для прогнозирования тяжести ее течения, представляется чрезвычайно актуальным.
Цель исследования – изучить частоту встречаемости генотипов полиморфного маркера гена эндотелина-1 (EDN1 Lys198Asn) и синтазы окиси азота (NOS3 C786T) у детей при гриппе А H1N1/v, осложненном пневмонией.
Материал и методы. В исследование включено 137 детей с внебольничной пневмонией. Основную группу исследуемых составили 87 детей с внебольничной пневмонией, как осложнение пандемического гриппа А H1N1/v, проходивших стационарное лечение в государственном учреждении здравоохранения «Краевая клиническая инфекционная больница» (Забайкальский край) в эпидемический сезон октябрь-декабрь 2009 года по гриппу А H1N1/v. Пневмония в данной группе носила вторичный вирусно-бактериальный характер. Группу сравнения для основной группы составили 50 детей с внебольничной пневмонией в постэпидемический по гриппу период. Дети с атипичной этиологией внебольничной пневмонии (микоплазменная, хламидийная) из данной группы исключались. Распределение исследуемых по группам, полу и возрасту представлены в табл.1.
В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki (1964, 2000 - поправки) и Правилами клинической практики в Российской Федерации", утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266.
Таблица 1. Распределение больных по группам, полу и возрасту
Диагноз внебольничной пневмонии устанавливался на основании достоверных критериев, предложенных А.Г. Чучалиным и соавт. [1]. В качестве критериев тяжести внебольничной пневмонии у детей использовали модифицированную шкалу тяжелых внебольничных пневмоний у взрослых (2007) [8]. Все пациенты с тяжелым течением внебольничной пневмонии соответствовали критериям ССВР, предложенные Международной согласительной конференции по педиатрическому сепсису (2005) [6].
Этиологическую связь с вирусом гриппа А H1N1/v у детей с пневмонией в сезон циркуляции пандемического гриппа подтверждали путем обнаружения РНК вируса в назофарингеальных мазках методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и/или с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в парных сыворотках с нарастанием тира антител. Детей с внебольничной пневмонией в постэпидемический период по гриппу А H1N1/v тестировали методом ПЦР (назофарингеальные мазки) на группу респираторных вирусов (вирусы гриппа А H1N1/v, A H3N2, типа В, парагриппа 1-3 серотипов, аденовирусы, респираторно-синцитиальный вирус, риновирусы, метапневмовирус, бокавирус).
В качестве контрольной группы для оценки распределения генотипов исследуемых полиморфизмов в популяции обследовано 200 здоровых детей, сопоставимых по полу и возрасту с основной группой.
Материалом для молекулярно-генетического анализа служили образцы ДНК, выделенные из периферической венозной крови. Для исследования выбрана точка мутации эндотелина-1 (EDN1) в позиции 198 (Lys>Asn) и эндотелиальной синтазы окиси азота (NOS3) в позиции 786 (C>T).
Амплификацию проводили в термоцикле (модель Ре «Бис» - М111 (ООО «Бис-Н», Новосибирск). В работе использовались стандартные наборы праймеров научно-производственной фирмы «Литех»-«SNP» (Москва). Визуализация продуктов амплификации выполнена с помощью электрофореза в 3% агарозном геле с добавлением бромистого этидия, проходящем в ультрафиолетовом свете.
Полученные данные подвергали статистической обработке с помощью программы «BIOSTAT». При сравнении частот и групп по качественному бинарному признаку пользовались критерием χ2. Различия считались статистически значимыми при p<0,05. Для определения частот аллельных вариантов генов применялся закон Харди-Вайнберга. С целью оценки ассоциаций аллелей с генотипом рассчитывали относительный риск (ОР) и отношение шансов (ОШ).
Результаты исследования и их обсуждение. Распределение распространенности генотипов полиморфного локуса С786Т гена NOS3 и Lys198Asn гена EDN1 в группе больных и контрольной группе соответствовало ожидаемому равновесию Харди-Вайнберга.
По данным распределения распространенности генотипов гена EDN1 Lys198Asn у больных с пневмонией получены достоверные различия с группой здоровых лиц (табл.2).
Таблица 2. Распределение генотипов EDN1 (Lys198Asn) среди больных с пневмонией и здоровых индивидуумов
Примечание: здесь и далее * - статистическая значимость различий с контролем; ** - статистическая значимость различий с группой клинического сравнения
Причем, данные различия затрагивают исключительно группу пациентов с пневмонией при гриппе A H1N1/v (р=0,0001). Так, распределение генотипов Lys/Lys, Lys/Asn и Asn/Asn оказалось одинаково частым у здоровых детей и у больных с нетяжелым и тяжелым течением внебольничной пневмонии, этиологически не связанной с вирусом гриппа A H1N1/v (соответственно, р=0,102, р=0,161). Кроме того, частота выявления этих же генотипов не отличалась и у пациентов с различной тяжестью течения внебольничной пневмонии вне эпидемического сезона по гриппу (р=0,26). В тоже время у детей при тяжелой пневмонии, обусловленной пандемическим вирусом гриппа, частота регистрации исследуемых генотипов отличалась не только от группы здоровых лиц, но и от пациентов группы сравнения (р=0,022) и детей с нетяжелым течением пневмонии в сезон циркуляции гриппа A H1N1/v (р=0,04). У пациентов при тяжелом течении пневмонии при гриппе относительно детей группы сравнения с тяжелым течением пневмонии генотип Asn/Asn обнаруживался чаще в 2,2 раза, а генотип Lys/Asn – чаще в 1,9 раза.
Оценивая частоту аллельных вариантов гена EDN1 Lys198Asn выявлено, что в отличие от группы контроля и группы сравнения, пневмонии при пандемическом гриппе сопровождаются более редким обнаружением аллели Lys (тяжелое течение - 0,6, нетяжелое – 0,7, р=0,0001) (табл.3).
Соответственно, мутантная аллель Asn у детей при гриппе, осложненном пневмонией, выявлялась чаще в сопоставлении со здоровыми индивидуумами и пациентами группы сравнения (соответственно, р=0,0001, р=0,002). Достоверных отличий распространенности аллели Asn у детей с различной тяжестью течения пневмонии при гриппе нами не выявлены (р=0,182). Расчет относительного риска выявил положительную ассоциацию данного аллеля с тяжелым течением пневмонии при гриппе A H1N1/v (ОР=1,37, ДИ [-0,39; 2,12]). Тогда как аллель Lys при тяжелом течении пневмонии у детей с гриппом оказывала протективное действие (ОР=0,72, ДИ [-2,12; 0,39]).
Распределение генотипов NOS3 (C786T) у здоровых лиц и у пациентов с гриппом представлены в табл.4.
Таблица 3. Частота аллельных вариантов в гене EDN1 полиморфизма Lys198Asn среди больных с пневмонией и здоровых индивидуумов, (Р)
Таблица 4. Распределение генотипов NOS3 (C786T) среди больных с пневмонией и здоровых индивидуумов
Согласно полученным данным, частота генотипов С/С и Т/Т отличалась от группы контроля только у больных с пневмонией в сезон циркуляции вируса гриппа A H1N1/v как при тяжелом, так и нетяжелом ее течении (р=0,05, р=0,0001, соответственно). Частота генотипа С/Т отличалась от здоровых лиц только при тяжелом течении пневмонии при гриппе A H1N1/v (р=0,0001). Тяжелая пневмония у детей в период циркуляции гриппа характеризовалась достоверно частым обнаружением генотипа Т/Т в сравнении не только с группой контроля, но и группой сравнения (р=0,0001). В тоже время статистически значимые различия распределения генотипов NOS3 (C786T) при различном течении пневмонии при гриппе нами не выявлены.
При сравнении частоты аллельных вариантов С и Т гена NOS3 С786Т обнаружены статистически достоверные различия со здоровыми детьми только у больных при тяжелом течении пневмонии при гриппе (р=0,003) (табл.5). Причем частота аллели Т регистрировалась чаще у пациентов этой группы и в сопоставлении с группой сравнения (р=0,003), но не отличалась от больных с нетяжелой пневмонией при гриппе (р=0,182).
Таблица 5. Частота аллельных вариантов в гене NOS3 полиморфизма C786T среди больных с пневмонией и здоровых индивидуумов, (Р)
Расчет относительного риска выявил положительную ассоциацию аллеля Т гена NOS3 полиморфизма C786T с тяжелым течением пневмонии при гриппе A H1N1/v (ОР=1,5, ДИ [-1,0; 3,21]).
Таким образом, определение полиморфизма генов молекул, характеризующих дисфункцию эндотелия, дает возможность осуществлять индивидуальный прогноз при пневмонии, ассоциированной с вирусом пандемического гриппа, позволяя тем самым расширить перечень хорошо известных предикторов тяжести ее течения в детском возрасте и повысить вероятность прогноза.
Выводы:
1. Распространённость генотипа Lys/Asn полиморфного маркера гена EDN1 Lys198Asn выше у детей с внебольничной пневмонией при гриппе A H1N1/v, независимо от тяжести ее течения.
2. Генотип Т/Т полиморфизма гена NOS3 (С786Т) встречается чаще у пациентов с тяжелым течением пневмонии в сезон циркуляции вируса пандемического гриппа.
3. Тяжелое течение пневмонии при гриппе A H1N1/v у детей ассоциировано с аллелем Asn гена EDN1 полиморфизма Lys198Asn и аллелем Т гена полиморфизма гена NOS3 (С786Т).
4. Аллель Lys гена EDN1 полиморфизма Lys198Asn может быть расценен как фактор защиты при пневмонии у детей с гриппом A H1N1/v.
5. Частота распределения генотипов гена EDN1 полиморфизма Lys198Asn и гена NOS3 (С786Т) у детей с внебольничной пневмонией вне эпидемического сезона по гриппу, независимо от тяжести ее течения, не отличается от здоровых лиц.