Вопросы своевременной диагностики и рациональной лечебной тактики при перитонеальных спаечных процессах продолжают оставаться одной из сложных и весьма актуальных проблем абдоминальной хирургии.
На сегодняшний день не вызывает сомнения тот факт, что развитие послеоперационного адгезиогенеза в брюшной полости является сложным многокомпонентным процессом, в котором ведущую роль играет сама операционная травма, измененная иммунобиологическая реактивность организма и генетическая предрасположенность, обуславливающая нарушение синтеза коллагена [13].
Известно, что функциональное состояние фагоцитов во многом определяет течение и исход воспалительного процесса в брюшной полости. Выраженность спайкообразования зависит от клеточного состава перитонеального экссудата, функциональной активности клеток, наличия цитокинов и других биологически активных веществ. Имеются данные об иммунных механизмах в патогенезе спаечного процесса [5, 11, 16, 17]. Однако при этом, нет единого мнения о состоянии местного иммунитета при формировании перитонеальных спаек, не определено значение иммунных механизмов в регенерации брюшины и образовании спаечных сращений, недостаточно исследованы возможности влияния на функциональную активность перитонеальных макрофагов, как одного из звеньев сложного патогенеза спайкообразования [3].
На сегодняшний день предложено множество способов профилактики интраабдоминального спайкообразования. Широкое распространение получила идея по введению в брюшную полость во время операции различных антиспаечных средств, которые можно разделить на лекарственные препараты, и, так называемые, «барьеры», т.е. вещества, способные разобщить раневые поверхности брюшины на время их ремезотелизации [1, 6]. Сложность процесса формирования спаек дает широкие возможности для фармакологического вмешательства. Лекарственное воздействие может быть направлено против различных причин и компонентов воспалительного процесса, который может возникать в брюшной полости. В качестве противоспаечных препаратов были предложены нестероидные противовоспалительные средства, гормоны, фосфолипиды, антикоагулянты, фибринолитики [9]. При этом, практически не исследованным остается вопрос о возможности использования для профилактики избыточного адгезиогенеза веществ, способных влиять на синтез и метаболизм коллагена [15].
Наше внимание в этой связи привлек D-пеницилламин, который обладает высокой комплексообразующей способностью, подавляет синтез коллагена, обладает иммуномодулирующей активностью [8], т.е. такими фармакологическими свойствами, которые потенциально могут влиять на процесс спайкообразования. В качестве средства сравнения выбрано изделие медицинского назначения: гель противоспаечный «Мезогель» («Линтекс», Санкт-Петербург) с барьерным механизмом действия, эффективность которого подтверждена множеством экспериментальных и клинических исследований [1].
Учитывая важную роль перитонеальных макрофагов в развитии избыточного послеоперационного спайкообразования, сохраняет свою актуальность поиск средств, способных модифицировать функционально-метаболическую активность первых таким образом, чтобы максимально снизить выраженность адгезиогенеза в брюшной полости, индуцированного оперативным вмешательством.
Цель работы – изучить возможность фармакологической коррекции функционально-метаболической активности перитонеальных макрофагов при экспериментальном спаечном процессе в брюшной полости D-пеницилламином и «Мезогелем».
Материалы и методы.
Работа проводилась на крысах Wistar массой 180-200 г. Операции и все манипуляции с животными проводились с использованием общего обезболивания при соблюдении принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986) и правил лабораторной практики РФ (Приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.). Спаечный процесс в брюшной полости (СПБП) моделировался асептическим травматическим способом: брюшина вентральной стенки после предварительной гидравлической препаровки с помощью 3 мл 0,9% раствора хлорида натрия, отсепаровывалась и иссекалась на площади 1 см2. Слепая кишка на всей поверхности подвергалась скарификации до появления на ее поверхности «кровавой росы».
Способы, дозировки и кратность введения препаратов экспериментальным животным представлены в табл. 1. Перерасчет доз с человека (средний вес 70 кг) на животных – белых крыс производился в сторону увеличения в 5,9 раза.
Выделение перитонеальных макрофагов осуществлялось на 7-е и 14-е сутки после моделирования СПБП. Через прокол передней брюшной стенки в брюшную полость умерщвленных животных вводили 10 мл стерильного охлажденного раствора Хенкса, производили энергичный массаж брюшной стенки и откачивали перитонеальный экссудат (клетки хранили на льду не более 10 мин). Макрофаги отделяли от других клеток путем их адгезии к поверхности пластиковых чашек Петри в присутствии инактивированной человеческой сыворотки. Неприкрепившиеся клетки удаляли, а адгезированные клетки отделяли инкубацией с ЭДТА. Полученный осадок ресуспендировали в 4 мл раствора Хенкса.
Фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов оценивалась по фагоцитарному показателю, фагоцитарному числу и индексу активности фагоцитоза (ФП, ФЧ, ИАФ) [7].
Кислородзависимую бактерицидную активность перитонеальных макрофагов оценивали в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест). Параллельно со спонтанным (НСТ-сп.), ставили стимулированный НСТ-тест (НСТ-инд.), при этом в качестве стимулятора использовали зимозан. Для оценки функциональной активности определяли при микроскопии количество (в %) диформазан-положительных клеток в спонтанном и стимулированном тесте восстановления НСТ. Рассчитывали функциональный резерв нейтрофилов (ФРН) – разницу между диформазан-позитивными клетками в стимулированной реакции и диформазан-позитивными клетками в спонтанной реакции НСТ-теста [14].
Таблица 1. Препараты, дозировки, способы и кратность введения крысам со СПБП
Статистическую обработку результатов исследования проводили путем вычисления средней арифметической и ошибки средней. Гипотеза о нормальности распределения признаков внутри группы проверялась с использованием критерия Шапиро-Уилка. Однородность групповых дисперсий проверялась с помощью критерия Ливиня. Достоверность статистических различий средних арифметических величин оценивалась с использованием критериев Стьюдента с поправкой Бонферрони и Крускала-Уоллиса. Статистически значимыми считали различия с p<0,05.
Результаты и обсуждение. Основную ответственность за адгезивный процесс в брюшной полости несут фибробласты. Известно, что эти клетки синтезируют молекулы тропоколлагена, выбрасывают их в матрикс, где происходит сборка коллагеновых волокон и в конечном итоге формирование спаек. При этом в организме параллельно происходит процесс разрушения коллагена. Установлено, что макрофаги способны не только потенцировать дифференцировку и рост фибробластов, но и угнетать их активность, и даже «переквалифицировать» их в фиброкласты, способные к деструкции новообразованного коллагена [2]. Таким образом, макрофаг является центральной клеткой в управлении процессами репарации, главным инструментом которого являются межклеточные взаимодействия, основанные на принципе обратной связи и хемотаксисе. Макрофаг – это регулятор активности фибробластов, их дифференцировки и продукции коллагена [12]. В этой связи нами была изучена функционально-метаболическая активность перитонеальных макрофагов на разных сроках формирования спаек и возможности ее фармакологической и нефармакологической коррекции.
При моделировании спаечного процесса в брюшной полости на 7-е сутки установлено повышение функциональной активности перитонеальных макрофагов, что выражалось в увеличении ФП, ФЧ и ИАФ. К 14-м суткам наблюдалось достоверное снижение исследуемых показателей, однако уровня интактных крыс они так и не достигали (рис. 1).
Интраабдоминальное введение «Мезогеля» к 7-м суткам достоверно снижало ФЧ (но не до контрольных значений), увеличивало ФП и в итоге не влияло на ИАФ. На 14-е сутки в этой группе не отличалось от нормальных только ФЧ, а ФП и ИАФ были выше, чем у здоровых животных, при этом значение последнего показателя было достоверно ниже, чем у животных на фоне моделирования СПБП без коррекции.
Использование различных способов введения D-пеницилламина для профилактики спаечной болезни равноценно приводило на 7-е сутки к достоверному уменьшению ФЧ и ИАФ, а ФП значимо снижался, но не до нормальных значений, только при локальном применении этого препарата. Через две недели после моделирования СПБП при всех схемах монотерапии D-пеницилламином достоверно снижались ИАФ и ФЧ, последний показатель в схеме с локальным внутрибрюшинным введением данного препарата не отличался от уровня интактных крыс.
Сочетанное использование «Мезогеля» и D-пеницилламина эффективно корригировало выявленные нарушения фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов на всех сроках наблюдения, причем наибольшей фармакологической активностью обладала схема, где использовалось внутрибрюшное введение как «Мезогеля», так и D-пеницилламина. Данная фармакологическая схема позволяла нормализовать все исследуемые показатели уже к 7-м суткам эксперимента (рис. 1).
Динамика нарушений кислородзависимых бактерицидных механизмов перитонеальных макрофагов в процессе формирования спаек характеризовалась следующими закономерностями: к 7-м суткам отмечалось достоверное увеличение показателей НСТ-теста как в спонтанной, так и стимулированной реакции. Более выраженное повышение НСТ-сп. в сравнении с НСТ-инд. приводило к уменьшению ФРН. На 14-е сутки вектор изменений изучаемых показателей сохранял свое направление, но степень выраженности нарушений метаболической активности перитонеальных макрофагов была достоверно меньшей, за исключением НСТ-инд. (рис. 2).
Рис. 1. Изменения фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов при СПБП на 7 и 14-е сутки и ее коррекция D-пеницилламином и «Мезогелем»: здесь и на рис. 2 *К - р<0,05 по отношению к интактным животным (К); треугольники - р<0,05 по отношению к аналогичным показателям крыс на 7-е сутки эксперимента.
Рис. 2. Изменения кислородзависимой бактерицидной активности перитонеальных макрофагов при СПБП на 7 и 14-е сутки и ее коррекция D-пеницилламином и «Мезогелем».
Внутрибрюшное введение «Мезогеля» достоверно уменьшало, но не нормализовало НСТ-сп. и значимо увеличивало ФРН в течение первых 7-ми суток эксперимента. Через 14 дней после использования «Мезогеля» НСТ-сп. еще больше уменьшался, происходила нормализация НСТ-инд., а ФРН оставался достоверно ниже, чем в контрольной группе и не отличался от показателя 7-го дня эксперимента.
Монотерапия D-пеницилламином с использованием различных способов введения последнего характеризовалась теми же векторами изменений основных показателей, отражающих кислородзависимую бактерицидность перитонеальных макрофагов, что и при применении «Мезогеля» и не имела достоверных фармакологических преимуществ перед последним на всех сроках наблюдения.
Сочетанное использование внутрибрюшинного введения «Мезогеля» и внутрижелудочного D-пеницилламина, более значимо, чем каждый из препаратов в отдельности к 7-м суткам снижало НСТ-сп. и НСТ-инд., последний достигал показателей здоровых животных, и повышало ФРН. Через 14 суток после моделирования СПБП и использования указанной фармакологической схемы все исследуемые показатели не отличались от контрольных значений интактных крыс. Изменение способа введения D-пеницилламина с внутрижелудочного на локальный внутрибрюшной повысило эффективность предложенной фармакологической схемы, что нашло отражение в сроках нормализации показателей кислородзависимой метаболической активности перитонеальных макрофагов в процессе формирования внутрибрюшных спаек – уже к 7-м суткам эксперимента (рис. 2).
Заключение. Ранее нами установлен факт угнетения функционально-метаболической активности нейтрофилов периферической крови крыс в процессе развития спаечной болезни как на 7-е, так и на 14-е сутки эксперимента [3]. При исследовании функционально-метаболической активности перитонеальных макрофагов выявлен обратный вектор изменений в эти же сроки - увеличение активности. Вероятно, это связано с тем, что в результате повреждения мезотелия локальное воспаление брюшины вызывает миграцию в очаг активных полиморфноядерных лейкоцитов, которые пребывают в этой зоне около 5-6 суток. Затем наблюдается постепенное замещение нейтрофилов популяцией макрофагов, которые «работают» в месте альтерации вплоть до купирования воспалительной реакции.
Установлено, что использование «Мезогеля» уменьшает функционально-метаболическую активность избыточно активированных перитонеальных макрофагов (по-видимому, за счет создания «барьера» для гидрофлотации участков повреждённой брюшины, приводя к нарушению миграции и взаимодействия иммунных клеток посредством цитокинов), что, возможно, отчасти и обуславливает его антиадгезивные свойства наряду с барьерным действием. Однако, иммуносупрессорные эффекты последнего в отношении показателей адаптивного и врожденного иммунитета на системном уровне [3,10] сохраняли актуальным поиск средств, которые могли нивелировать этот побочный эффект «Мезогеля» и усилить его противоспаечную активность. В этой связи использование D-пеницилламина, должно было оказаться оптимальным, поскольку он обладает доказанной иммуномодулирующей активностью, способен угнетать синтез коллагена и связывать ионы кальция, участвующие в образовании нерастворимого фибрина.
В результате исследования было установлено, что на местном уровне монотерапия D-пеницилламином уменьшала активность перитонеальных макрофагов и в отличие от «Мезогеля» не обладала способностью к неспецифической активации отдельных показателей их фагоцитарной функции. При этом максимальная иммунокорригирующая активность наблюдалась именно при сочетанном применении D-пеницилламина и «Мезогеля», причем в схеме с локальным введением обоих препаратов.
Таким образом, следует отметить, что при совместном использовании D-пеницилламина и «Мезогеля» происходила инверсия их иммуносупрессирующих свойств на иммуностимулирующие в отношении функционально-метаболической активности нейтрофилов периферической крови [3] и суммация первых в отношении тех же свойств перитонеальных макрофагов, в обоих случаях приводившие к нормализации нарушенных показателей врожденного иммунитета на системном и локальном уровне. Полученные закономерности можно объяснить с позиции инверсной иммуномодуляции, которая реализуется при участии легких и тяжелых эритроцитов [4].
Выводы
1.Сочетанное применение D-пеницилламина и «Мезогеля» для профилактики экспериментальной спаечной болезни брюшины достоверно корригирует или нормализует функционально-метаболическую активность перитонеальных макрофагов в зависимости от способа введения D-пеницилламина.
2. По степени возрастания иммунокорригирующей активности в отношении перитонеальных макрофагов исследованные схемы располагаются в следующей последовательности: D-пеницилламин внутрижелудочно → D-пеницилламин внутрибрюшинно → D-пеницилламин внутрижелудочно + «Мезогель» → D-пеницилламин внутрибрюшинно + «Мезогель».