Введение. В настоящее время одними из наиболее широко используемых лекарственных препаратов во всем мире являются нестероидные противовоспалительные средства (НПВС). Свойствами НПВС обладают препараты различной химической структуры. Среди них имеются производные кислот (индолуксусной, фенилуксусной, пропионовой, салициловой), оксикамов, коксибов. Известно, что наряду с противовоспалительным, обезболивающим, жаропонижающим эффектами, многие нестероидные противовоспалительные средства вызывают ряд серьезных побочных реакций, в том числе эрозивно-язвенные поражения желудочно-кишечного тракта, выраженные изменения функции печени, почек и другие нарушения. Появление препаратов, обладающих способностью избирательно угнетать активность циклооксигеназы-2, не позволило полностью решить проблему их безопасности. В связи с этим в настоящее время по-прежнему актуальным является поиск новых противовоспалительных средств с улучшенным профилем безопасности, в том числе не обладающих ульцерогенностью. Одной из перспективных групп для создания препаратов этой группы являются производные тиадиазола. Известно, что наличие ядра тиадиазола увеличивает липофильность многих соединений, тем самым увеличивая их биодоступность, а также повышает их избирательность к циклооксигеназе-2 [1, 2]. В экспериментах на животных было показано, что ряд производных тиадиазола и органических кислот (пиколиновой, ацексамовой, оксоэтановой, пропионовой и других) проявляют свойства нестероидных противовоспалительных средств, обладая при этом невысокой токсичностью и низкой ульцерогенностью [1-4].
Целью настоящего исследования являлась экспериментальная оценка противовоспалительной активности нового аминокислотного производного тиадиазола при внутрижелудочном введении крысам.
Материалы и методы исследования. Объектом исследования было новое производное тиадиазола и ацексамовой кислоты с лабораторным шифром ЛХТ7-09, синтезированное в ОАО «ВНЦ БАВ» проф. С.Я. Скачиловой. Это соединение по внешнему виду представляет собой порошок белого цвета, который практически не растворим в воде, растворим в спирте. Химическая структура нового производного тиадиазола и ацексамовой кислоты показана на рис.1.
Рис. 1. Химическая структура ЛХТ7-09 (брутто формула: С12Н2N4О2S; молярная масса 284,2 г/моль): (2-(5-этил-1,3,4-тиадиазолил) амид 2-ацетиламиногексановой кислоты).
Оценку противовоспалительной активности ЛХТ7-09 проводили в экспериментах на 72 белых неинбредных крысах обоего пола массой 183,2±1,6 г с использованием моделей острого воспалительного отека и хронического пролиферативного воспаления [6, 7]. В качестве препарата сравнения использовали нестероидное противовоспалительное средство из группы производных пропионовой кислоты кетопрофен (ОАО «Синтез», РФ).
Острый воспалительный отек у подопытных животных воспроизводили субплантарным введением в заднюю лапу крысы 0,1 мл 2% водного раствора формалина. Выраженность отека оценивали, измеряя толщину лапы подопытного животного с помощью инженерного электронного штангенциркуля Vorel 15240 (Польша) до и спустя 2, 4, 6, 24 и 48 часов после введения раствора формалина. ЛХТ7-09 и кетопрофен вводили подопытным животным однократно внутрижелудочно в дозах 0,05 DL50 (21,5 мг/кг и 23 мг/кг соответственно) за 1 час до индукции отека лапы формалином. Животные контрольной группы получали внутрижелудочно изотонический раствор натрия хлорида. В каждой серии опытов использовали по 10 животных.
Выраженность воспалительной реакции оценивали по приросту толщины лапы подопытных животных (формула 1).
где П (%) - прирост толщины лапы, О - толщина лапы после введения раствора формалина в мм, И - толщина лапы до введения раствора формалина в мм.
Противовоспалительную активность исследуемого соединения выражали в процентах угнетения отека, рассчитанного по формуле 2:
где УО (%) - угнетение отека в процентах, По - прирост толщины лапы в опыте, Пк - прирост толщины лапы в контроле.
Определение среднеэффективной дозы (ED50) ЛХТ7-09 в отношении острого воспаления осуществляли с помощью пробит-анализа с вычислением линейного уравнения регрессии. С этой целью противовоспалительную активность исследуемого соединения оценивали при однократном внутрижелудочном введении в дозах 4,3 мг/кг (1/100 DL50), 21,5мг/кг (1/20 DL50), 43 мг/кг (1/10 DL50), 86,1 мг/кг (1/5 DL50). Критерием эффективности считали достоверное уменьшение отека лапы крысы на 30% и более по сравнению с контролем (изотонический раствор натрия хлорида) через 3 часа после индукции воспаления [6].
Влияние ЛХТ7-09 на течение хронического пролиферативного воспаления оценивали на модели фетровой гранулемы у крыс. Воспаление вызывали имплантацией под кожу медиальной части спины четырех простерилизованных фетровых дисков массой около 10 мг. Операцию выполняли под легким эфирным наркозом. В асептических условиях на предварительно выбритых участках ножницами делали разрез кожи и подкожной клетчатки длиной около 1 см, пинцетом в подкожной клетчатке через разрез формировали полость, в которую помещали простерилизованный фетровый диск, после чего на рану накладывали два шва. На 8-е сутки после операции фетровые диски с образовавшейся вокруг них грануляционной тканью извлекали, взвешивали на аналитических весах и высушивали до постоянной массы при 60°С. Пролиферативную реакцию оценивали по разнице между массой высушенной гранулемы и исходной массой фетрового диска (формула 3).
Экссудативную реакцию оценивали по разнице между массой влажной и высушенной гранулемы (формула 4). Исследуемое соединение ЛХТ7-09, а также препарат сравнения вводили подопытным крысам внутрижелудочно ежедневно, в течение 7 дней.
где ПР - пролиферативная реакция, ЭР - экссудативная реакция, Мсух - масса гранулемы после высушивания, Мисх - исходная масса фетрового диска, Мвл - масса влажной гранулемы.
Противовоспалительную активность в отношении экссудативной и пролиферативной реакции выражали в процентах по отношению к контролю (формулы 5 и 6) [6]:
где Тп(%) - торможение пролиферативной реакции в процентах, Тэ(%) - торможение экссудативной реакции в процентах, ПР - пролиферативная реакция, ЭР - экссудативная реакция.
Исследуемые соединения вводили подопытным животным внутрижелудочно ежедневно в течение 7 дней в дозе 0,05 DL50. Животные контрольной группы получали внутрижелудочно изотонический раствор натрия хлорида. В каждой серии опытов использовали по 10 животных.
Результаты исследований обрабатывали статистически с применением программного обеспечения «AnalystSoft Inc., BioStat - программа статистического анализа. Версия 2009». Для ряда выборок вычисляли среднюю арифметическую и среднюю квадратическую ошибку. Определение нормальности распределения переменных проводили на основании гистограмм распределения, величины асимметрии и эксцессы. Для оценки достоверности различий выборок, имеющих нормальное распределение, применяли параметрический t-критерий Стьюдента. За достоверное принимали различие при уровне вероятности 95% и более (p <0,05).
Результаты и обсуждение. Результаты исследования показали, что при субплантарном введении 0,1 мл 2% раствора формалина у крыс группы контроля развивался выраженный отек лапы, который сохранялся на протяжении 24 часов после его индукции. При внутрижелудочном введении ЛХТ7-09 (21,5 мг/кг) и кетопрофена (23 мг/кг) отмечалось существенное уменьшение выраженности формалин-индуцированного отека лапы у подопытных животных. Так, через 2 часа после введения формалина толщина лапы у подопытных крыс, получавших ЛХТ7-09 (21,5 мг/кг) и кетопрофен (23,0 мг/кг) была соответственно в 1,44 раза (р<0,05) и 1,15 раза (р<0,05) меньше, чем в контроле.
Следует отметить, что при внутрижелудочном введении ЛХТ7-09 наибольшая выраженность отека лапы (в среднем на 30,9% по сравнению с контролем) отмечалась через 2 часа после его индукции, тогда как при введении кетопрофена и у животных группы контроля через 4 часа. Через 24 часа у подопытных животных, получавших ЛХТ7-09 отека лапы отмечено не было. В серии опытов с введением кетопрофена в эти сроки отек был в среднем на 45,1% меньше, чем в контроле (табл. 1).
Таблица 1. Влияние ЛХТ7-09 и кетопрофена на выраженность формалин-индуцированного отека лапы у крыс
Примечание: * - различие с контролем достоверно (р<0,05).
На следующем этапе экспериментального исследования проводили анализ зависимости противовоспалительной активности ЛХТ7-09 при формалин-индуцированном отеке лапы у крыс в зависимости от дозы. С этой целью для 4-х доз (1/100 DL50, 1/20 DL50, 1/10 DL50, 1/5 DL50) определяли число животных (в %), у которых выраженность отека лапы уменьшалась на 30% и более по сравнению с контролем. Эффекты для каждой дозы переводили в пробиты и определяли значение десятичного логарифма соответствующей дозы. Отмечено, что противовоспалительная активность ЛХТ7-09 носила дозозависимый характер. Результаты исследования приведены в табл. 2.
Таблица 2. Зависимость противовоспалительной активности ЛХТ7-09 от дозы при формалин-индуцированном отеке лапы у крыс
Примечание: учитывали число подопытных животных, у которых отмечалось угнетение отека на 30% и более по сравнению с контролем.
Для определения среднеэффективной дозы ЛХТ7-09 использовали метод наименьших квадратов, с помощью которого составили линейное уравнение регрессии вида lgD = 0,426 p - 0,99, где р - выраженность противовоспалительного эффекта в пробитах.
Проведенные расчеты показали, что значения ED16, ED50, ED84 для противовоспалительной активности ЛХТ7-09 при формалин-индуцированном отеке составили соответственно 5,28; 13,80; 36,45 мг/кг.
Графическое изображение зависимости противовоспалительного эффекта ЛХТ 7-09 в пробитах от десятичного логарифма дозы представлено на рис. 2. Отмечено, что широта терапевтического действия ЛХТ 7-09 составила 31,16, что в среднем в 2,23 раза больше, чем у кетопрофена.
Рис. 2. Зависимость противовоспалительного эффекта (в пробитах) от десятичного логарифма дозы ЛХТ7-09 при формалин-индуцированном отеке лапы у крыс.
Наличие противовоспалительной активности у нового производного тиадиазола и ацексамовой кислоты было подтверждено при хроническом пролиферативном воспалении у крыс при моделировании «фетровой» гранулемы.
Было выявлено, что у подопытных крыс, получавших ЛХТ7-09 (21,5 мг/кг) экссудативная реакция была в среднем (р<0,05) в 1,23 раза меньше, чем в контроле. В сериях опытов с введением кетопрофена в эквитоксической дозе, экссудативная реакция была в среднем 1,14 раза меньше, чем в контроле. Одновременно было выявлено, что ЛХТ7-09 угнетал и пролиферативную фазу воспаления в среднем на 83,3% (р<0,05) по сравнению с контролем, что в 1,28 раза (р<0,05) эффективнее, чем при использовании кетопрофена (таб. 3).
Таблица 3. Влияние ЛХТ7-09 и кетопрофена на течение хронического пролиферативного воспаления у крыс
Таким образом, результаты проведенного экспериментального исследования показали, что новое аминокислотное производное тиадиазола обладает выраженными противовоспалительными свойствами. Известно, что угнетение циклооксигеназы-2 является важнейшим аспектом механизма противовоспалительного действия НПВС, а ингибирование ЦОГ-1-зависимого синтеза простагландинов связано с основными побочными эффектами этих препаратов (поражение ЖКТ, нарушения почечного кровотока и агрегации тромбоцитов и др.). Наличие у соединения ЛХТ7-09 выраженной противовоспалительной активности наряду с низкой ульцерогенностью позволяет предположить о селективном ингибировании данным соединением ЦОГ-2. Имеются данные о различии в строении изоформ циклооксигеназы. Так, связывающий участок ЦОГ-2 имеет более крупные размеры и дополнительный гидрофильный участок, отличающийся остатками валина и аргинина, вместо изолейцина и гистидина в аминокислотной цепи ЦОГ-1. Химическая структура соединений, содержащих тиадиазоловое кольцо, возможно, позволяет им взаимодействовать с дополнительным участком ЦОГ-2, что и определяет селективность именно этого изофермента [10]. Наряду с угнетением ЦОГ, противовоспалительное действие НПВП может быть связано с торможением перекисного окисления липидов. Наличие в структуре ЛХТ7-09 тиадиазолового кольца, являющегося водород-связывающим доменом, а также донором электронов, возможно, придает исследуемому соединению свойства антиоксиданта [9]. Присутствие в строении ЛХТ7-09 атома серы придает этому соединению свойство липофильности, что позволяет ему хорошо проникать через клеточные мембраны и взаимодействовать с внутриклеточными мишенями разной направленности [11]. Кроме того, выраженный противовоспалительный эффект нового аминокислотного производного тиадиазола может быть связан с наличием в его структуре фрагмента ацексамовой кислоты [8].
Выводы
1. При внутрижелудочном введении ЛХТ7-09 в дозе 0,05 DL50 (21,5 мг/кг) отмечалось угнетение формалин-индуцированного отека лапы у крыс в среднем на 30,9% по сравнению с контролем и экссудативной фазы хронического пролиферативного воспаления у крыс в среднем на 18,8% по сравнению с контролем.
2. Противовоспалительная активность нового производного тиадиазола и ацексамовой кислоты в дозе 0,05 DL50 при формалин-индуцированном отеке лапы и хронической пролиферативной воспалительной реакции (фетровой гранулеме) у крыс была выше, чем у кетопрофена в эквитоксической дозе.
3. Среднеэффективная доза (ED50) ЛХТ7-09 при формалин-индуцированном отеке лапы у крыс составила 13,8 мг/кг.