Введение. Нестероидные противовоспалительные средства являются одними из наиболее востребованных лекарственных препаратов на фармацевтическом рынке, так как обладают противовоспалительной, обезболивающей и жаропонижающей активностями. Серьезным недостатком препаратов данного ряда является невысокий профиль безопасности, что ограничивает возможности их применения в клинической практике, в том числе в педиатрии, а также у пациентов с заболеваниями желудочно-кишечного тракта, печени, нарушениями свертывания крови и другими патологиями. Большинство современных нестероидных противовоспалительных средств являются производными различных органических кислот (индолуксусной, фенилуксусной, пропионовой, салициловой и др.). Наличие в их структуре свободной карбоксильной группы усиливает их ульцерогенный эффект. Известно, что введение в структуру различных соединений ядра тиадиазола придает им большую липофильность, тем самым увеличивая биодоступность, а также повышает их избирательность к циклооксигеназе-2 [1]. В экспериментах на животных было показано, что ряд производных 1,3,4-тиадиазолиламида и органических кислот (пиколиновой, оксоэтановой, пропионовой и других) проявляют свойства нестероидных противовоспалительных средств, обладая при этом невысокой токсичностью и низкой ульцерогенностью [1, 2-4, 6].
Целью настоящего исследования являлась экспериментальная оценка обезболивающей активности нового производного 1,3,4-тиадиазолиламида и ацексамовой кислоты при внутрижелудочном введении мышам и крысам.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования было новое производное 1,3,4-тиадиазолиламида и ацексамовой кислоты с лабораторным шифром ЛХТ 7-09, синтезированное в ОАО «ВНЦ БАВ» проф. С. Я. Скачиловой. Химическая структура нового производного тиадиазола и ацексамовой кислоты подтверждена масс-спектрометрически [5] и показана на рис.
Рис. 1. Химическая структура ЛХТ7-09: 2-(5-этил-1,3,4-тиадиазолил) амид 2-ацетиламиногексановой кислоты).
Оценку обезболивающей активности ЛХТ7-09 проводили в экспериментах на 96 белых неинбредных крысах обоего пола массой 194,2±2,1 г и 48 белых неинбредных мышах обоего пола массой 21,2±0,16 г с использованием моделей химического болевого раздражения брюшины у крыс, механического раздражения воспаленной лапы у крыс и горячей пластины у мышей. В качестве препарата сравнения использовали нестероидное противовоспалительное средство из группы производных пропионовой кислоты кетопрофен (ОАО «Синтез», РФ).
Повышенную болевую чувствительность воспаленных тканей (воспалительную гиперальгезию) вызывали субплантарным введением в подошвенный апоневроз лапы крысы 0,1 мл 2% раствора формалина. Оценку порога болевой чувствительности (ПБЧ) на механическое раздражение проводили до и через 3 часа после введения раствора формалина для воспаленной и интактной лапы с помощью анальгезиметра, обеспечивающего плавное увеличение нагрузки на лапу до появления болевой реакции (писк животного). Исследуемое соединение ЛХТ7-09, а также препарат сравнения вводили подопытным крысам внутрижелудочно через 2 часа после инъекции формалина. Анальгетический эффект оценивали по снижению гиперальгезии через 1 час после внутрижелудочного введения препаратов. Для анализа продолжительности обезболивающего действия измерения проводили также через 2, 3, 4, 5 часов.
В исследованиях на крысах специфическую болевую реакцию «корчи» вызывали внутрибрюшинным введением 1% раствора уксусной кислоты из расчета 0,5 мл на 100 г массы тела. Наблюдение за животными проводили в течение 1 часа после инъекции уксусной кислоты. Крыс, у которых не возникал ответ на введение раздражителя (характерные движения животных, включающие сокращения брюшных мышц, чередующиеся с их расслаблением, вытягиванием задних конечностей и прогибанием спины), в исследованиях не использовали. Исследуемое соединение, а также препарат сравнения, вводили подопытным крысам перорально за 60 минут до введения раствора уксусной кислоты. Каждое животное помещали в отдельный стеклянный контейнер и фиксировали общее количество специфических ноцицептивных ответов (корчей) в течение 15 минут.
Болевую реакцию у мышей вызывали помещением животного на горячую пластину с температурой 55ºС, регистрировали время достижения порога болевой чувствительности, определяемого по наступлению двигательных реакций беспокойства (одергивание лап, облизывание подушечек лап, подпрыгивание, писк) через 0,5, 1, 2 часа после введения препарата.
Результаты исследований обрабатывали статистически с применением программного обеспечения «AnalystSoft Inc., BioStat - программа статистического анализа. Версия 2009». Для ряда выборок вычисляли среднюю арифметическую и среднюю квадратическую ошибку. Определение нормальности распределения переменных проводили на основании гистограмм распределения, величины асимметрии и эксцесса. Для оценки достоверности различий выборок, имеющих нормальное распределение, применяли параметрический t-критерий Стьюдента. За достоверное принимали различие при уровне вероятности 95% и более (p<0,05).
Результаты и обсуждение
Результаты исследования показали, что у крыс группы контроля при субплантарном введении 0,1 мл 2% раствора формалина произошло снижение порога болевой чувствительности при давлении на воспаленную лапу, которое сохранилось на протяжении всего периода наблюдения. Так, до введения формалина нагрузка на воспаленную лапу, вызывающая болевые ощущения у животного (писк, отдергивание конечности), составила в среднем (p<0,05) 122,5 г. Через 3 часа после введения формалина порог болевой чувствительности снизился в среднем (p<0,05) до 66,7 г, что в 1,83 раза меньше, чем до индукции воспаления (табл. 1).
При внутрижелудочном введении ЛХТ7-09 (21,5 мг/кг) и кетопрофена (23,0 мг/кг) отмечалось существенное снижение выраженности воспалительной гиперальгезии. Так, через 3 часа после введения формалина порог болевой чувствительности у крыс, получавших ЛХТ7-09 (21,5 мг/кг) и кетопрофен (23,0 мг/кг) снизился соответственно в 1,2 раза (р<0,05) и 1,3 раза (р<0,05). При этом при введении ЛХТ 7-09 (21,5 мг/кг) и кетопрофена (23,0 мг/кг) выраженность воспалительной гиперальгезии по сравнению с контролем была снижена на 33,8% и 31,7% соответственно и сохранялась на протяжении всего времени наблюдения.
Вместе с тем, оценка порога болевой чувствительности на интактной лапе не выявила достоверных различий до и после введения ЛХТ 7-09, что, вероятно, свидетельствует об отсутствии анальгезии центрального происхождения.
Таблица 1. Влияние ЛХТ7-09 и кетопрофена на порог болевой чувствительности при механическом раздражении воспаленной лапы у крыс
Примечание: * - различие с контролем достоверно (р<0,05).
На следующем этапе экспериментального исследования проводили анализ зависимости обезболивающей активности ЛХТ7-09 при механическом раздражении воспаленной лапы у крыс в зависимости от дозы. С этой целью для 4-х доз (1/100 DL50, 1/20 DL50, 1/10 DL50, 1/5 DL50) определяли число животных (в %), у которых выраженность воспалительной гиперальгезии уменьшалась на 50% и более по сравнению с контролем. Эффекты для каждой дозы переводили в пробиты и определяли значение десятичного логарифма соответствующей дозы. Отмечено, что анальгетическая активность ЛХТ7-09 носила дозозависимый характер. Результаты исследования приведены в табл. 2.
Таблица 2. Зависимость анальгетической активности ЛХТ7-09 от дозы при механическом раздражении воспаленной лапы у крыс
Примечание: учитывали число подопытных животных, у которых отмечалось снижение гиперальгезии на 50% и более по сравнению с контролем.
Для определения среднеэффективной дозы ЛХТ7-09 использовали метод наименьших квадратов, с помощью которого составили линейное уравнение регрессии вида lgD = 0,419 p - 0,95, где р - выраженность противовоспалительного эффекта в пробитах.
Проведенные расчеты показали, что значения ED16, ED50, ED84 для обезболивающей активности ЛХТ7-09 при механическом раздражении воспаленной лапы у крыс составили 5,32; 13,96; 36,61 мг/кг соответственно.
Графическое изображение зависимости обезболивающего эффекта ЛХТ 7-09 в пробитах от десятичного логарифма дозы представлено на рис. 2. Отмечено, что терапевтический индекс ЛХТ 7-09 составил 30,83, что в среднем в 4,76 раза больше, чем у кетопрофена.
Рис. 2. Зависимость анальгетической активности (в пробитах) от десятичного логарифма дозы ЛХТ7-09 при механическом раздражении воспаленной лапы у крыс.
Наличие анальгетической активности у нового аминокислотного производного тиадиазола было подтверждено при химическом болевом раздражении брюшины у крыс, вызванном введением 0,75% раствора уксусной кислоты (0,1 мл/10 г массы тела). Результаты исследования показали, что у животных группы контроля число специфических ноцицептивных ответов при химическом раздражении брюшины составило 26,8±1,23 за 15 минут (табл. 3).
Таблица 3. Влияние ЛХТ7-09 и кетопрофена на число специфических ноцицептивных ответов (корчей) при химическом болевом раздражении брюшины у крыс
Примечание: * - различие с контролем достоверно (р<0,05).
В серии опытов с использованием ЛХТ 7-09 (21,5 мг/кг) число специфических ноцицептивных ответов на внутрибрюшинное введение уксусной кислоты было в среднем в 2,1 раза (р<0,05) меньше, чем в контроле. Вместе с тем было отмечено, что обезболивающая активность кетопрофена (23,0 мг/кг) при химическом раздражении брюшины у крыс достоверно не отличалась от исследуемого соединения.
На следующем этапе экспериментального исследования определяли зависимость обезболивающей активности ЛХТ7-09 при химическом болевом раздражении брюшины у крыс от дозы. С этой целью для 4-х доз (1/100 DL50, 1/20 DL50, 1/10 DL50, 1/5 DL50) определяли число животных (в %), у которых наблюдалось снижение болевой реакции на 50% и более по сравнению с контролем. Эффекты для каждой дозы переводили в пробиты и определяли значение десятичного логарифма соответствующей дозы. В результате исследования подтверждено, что анальгетическая активность ЛХТ7-09 носит дозозависимый характер. Результаты исследования приведены в табл. 4.
Таблица 4. Зависимость анальгетической активности ЛХТ7-09 от дозы при механическом раздражении воспаленной лапы у крыс
Примечание: учитывали число подопытных животных, у которых отмечалось снижение болевой реакции на 50% и более по сравнению с контролем.
Для определения среднеэффективной дозы ЛХТ7-09 использовали метод наименьших квадратов, с помощью которого составили линейное уравнение регрессии вида lgD = 0,405 p - 0,62, где р - выраженность противовоспалительного эффекта в пробитах.
Проведенные расчеты показали, что значения ED16, ED50, ED84 для обезболивающей активности ЛХТ7-09 при химическом болевом раздражении брюшины у крыс составили 9,83; 24,99; 63,51 мг/кг соответственно.
Графическое изображение зависимости обезболивающего эффекта ЛХТ7-09 в пробитах от десятичного логарифма дозы представлено на рисунке 3. Отмечено, что терапевтический индекс ЛХТ7-09 составил 17,2, что в среднем в 3,36 раза больше, чем у кетопрофена.
Рис. 3. Зависимость анальгетической активности (в пробитах) от десятичного логарифма дозы ЛХТ7-09 при химическом болевом раздражении брюшины у крыс.
Результаты теста горячей пластины у мышей подтвердили наличие обезболивающей активности у нового аминокислотного производного тиадиазола. Было обнаружено, что при помещении подопытных мышей группы контроля на горячую поверхность с температурой 55 °С время до появления оборонительного рефлекса (облизывание и отдергивание конечности от пластины, подпрыгивание) составило в среднем 11,27 с. В сериях опытов с внутрижелудочным введением ЛХТ7-09 (43,0 мг/кг) и кетопрофена (46 мг/кг) было выявлено достоверное увеличение порога болевой чувствительности. Так, через 30 минут, 1 час и 2 часа после введения ЛХТ7-09 (43,0 мг/кг) время до появления оборонительного рефлекса было соответственно в среднем в 1,25, 2,17, 2,18 раза (р<0,05) выше, чем в контроле. Однако, в тесте горячей пластины новое аминокислотное производное тиадиазола через 1 и 2 часа после введения уступало кетопрофену по обезболивающей активности соответственно в 1,3 и 1,5 раза (р<0,05) (табл. 5).
Таблица 5. Влияние ЛХТ 7-09 и кетопрофена на порог болевой чувствительности в тесте горячей пластины у мышей
Примечание: * - различие с контролем достоверно (р<0,05), # - различие с препаратом сравнения достоверно (р<0,05).
В тесте горячей пластины также был подтвержден дозозависимый характер обезболивающей активности соединения ЛХТ7-09. Зависимость «доза-эффект» определяли для 4-х уровней доз (1/100 DL50, 1/20 DL50, 1/10 DL50, 1/5 DL50) по числу животных (в %), у которых наблюдалось увеличение порога болевой чувствительности на 50% и более по сравнению с контролем. Эффекты для каждой дозы переводили в пробиты и определяли значение десятичного логарифма соответствующей дозы. Результаты исследования приведены в табл. 6.
Таблица 6. Зависимость анальгетической активности ЛХТ7-09 от дозы при термическом раздражении лапы у мышей
Примечание: учитывали число подопытных животных, у которых отмечалось увеличение времени до оборонительного рефлекса на 50% и более по сравнению с контролем.
Для определения среднеэффективной дозы ЛХТ7-09 использовали метод наименьших квадратов, с помощью которого составили линейное уравнение регрессии вида lgD = 0,42 p - 0,70, где р - выраженность противовоспалительного эффекта в пробитах.
Проведенные расчеты показали, что значения ED16, ED50, ED84 для обезболивающей активности ЛХТ7-09 при термическом раздражении лапы у мышей составили 9,67; 25,56; 67,53 мг/кг соответственно.
Графическое изображение зависимости обезболивающего эффекта ЛХТ7-09 в пробитах от десятичного логарифма дозы представлено на рис. 4. Отмечено, что терапевтический индекс ЛХТ7-09 составил 33,7, что в среднем в 20 раз больше, чем у кетопрофена.
Рис. 4. Зависимость анальгетической активности (в пробитах) от десятичного логарифма дозы ЛХТ7-09 при термическом раздражении лапы у мышей.
Таким образом, результаты проведенного экспериментального исследования доказали наличие обезболивающей активности у 2-(5-этил-1,3,4-тиадиазолил) амида 2-ацетиламиногексановой кислоты (ЛХТ7-09), что позволяет рассматривать данное соединение в качестве перспективного нестероидного противовоспалительного средства.