Туберкулез по-прежнему является одной из наиболее актуальных проблем здравоохранения Российской Федерации, что подтверждается высоким уровнем заболеваемости населения всеми формами туберкулеза [2]. Эффективность этиотропной противотуберкулезной терапии во многом зависит не только от устойчивости микобактериальной флоры, но и от развития нежелательных побочных реакций, которые часто становятся причиной удлинения сроков терапии и отмены препаратов.
Туберкулез является инфекционным заболеванием, для которого характерно длительное течение и выраженная перестройка многих биохимических процессов протекающих в организме, как вследствие влияния возбудителя, так и вследствие длительного приема противотуберкулезных химиопрепаратов.
Комбинированная этиотропная химиотерапия является основным компонентом лечения туберкулеза. Применяются одновременно несколько противотуберкулезных препаратов основными из которых являются препараты первого ряда: изониазид, рифампицин, пиразинамид и этамбутол. Этиотропная терапия оказывает различное токсическое влияние на органы гепатобилиарной, нервной, иммунной и других систем [3, 4]. Чаще всего нежелательные побочные реакции на противотуберкулезные препараты наблюдаются в течение интенсивной фазы основного курса противотуберкулезной терапии. В литературе крайне мало работ, описывающих иммунотропный эффект противотуберкулезных препаратов.
Важную роль в развитии иммунного ответа при туберкулезе играют клеточные реакции, зависящие от структурно-функционального состояния иммуноцитов. Очевидно, что изменение спектра клеточных липидов является важнейшим показателем иммунореактивности и является прямым отражением функционального состояния отдельных её элементов. Липиды мембран клеток крови служат молекулярной основой, определяющей их структурные и функциональные свойства [10].
Липидный и фосфолипидный спектр мембран мононуклеаров периферической крови является чувствительным параметром, отражающим различные биологические и химические воздействия на организм у больных туберкулезом легких.
Изменение соотношений отдельных фракций липидов может указывать на особенности патологических процессов, протекающих в организме человека под влиянием туберкулёзной инфекции и противотуберкулезных химиопрепаратов, составляющих основу этиотропной терапии больных туберкулезом. Наиболее чувствительны к инфекционному воздействию мембраны лимфоцитов и мононуклеаров [8, 9].
Состав и структурные особенности липидного бислоя мононуклеаров у больных туберкулезом определяют их способность тонко реагировать не только на воздействие факторов внешней среды, но и на изменения внутренней среды макроорганизма и отражают их функциональную активность.
Изучение процессов иммунной регуляции и патологических состояний, связанных с нарушением соотношений липидных компонентов мембран, является основой выработки новых подходов к иммунокоррегирующей терапии. Она создаст благоприятные условия для формирования адекватного иммунного ответа на всех фазах лечения туберкулеза, позволит сократить сроки и повысить эффективность терапии.
Целью настоящего исследования было выявить особенности изменения липидного спектра мононуклеарных лейкоцитов у больных туберкулезом легких до лечения и после окончания интенсивной фазы.
Материалы и методы. Все обследованные больные туберкулезом легких наблюдались нами в период с 2012-го по 2016 г. на базе Тверского областного клинического противотуберкулезного диспансера - всего 308 человек.
Все пациенты относились к лицам молодого и среднего возраста по градации, рекомендованной Всемирной организацией здравоохранения - от 25 до 60 лет. В группы были включены больные обоих полов в равном соотношении в соответствии с критериями включения-исключения.
Критерии включения: добровольное информированное согласие, отсутствие диагностированной сопутствующей соматической или инфекционной патологии, очаговый или инфильтративный туберкулез легких без распада, доказанная лекарственная чувствительность возбудителя к препаратам первого ряда (по крайней мере, к изониазиду и рифампицину) или отсутствие сведений о лекарственной чувствительности возбудителя и лечение по 1 стандартному режиму.
Критерии исключения: отказ от продолжения лечения, выявление сопутствующей патологии, появление распада, выявление множественной лекарственной устойчивости микобактериальной флоры или индивидуальной непереносимости препаратов 1 ряда.
Контрольную группу (контроль) составили 36 здоровых добровольцев в возрасте от 25 до 60 лет, обоих полов в равном соотношении. Без диагностированной сопутствующей соматической и инфекционной патологии.
Диагноз туберкулеза легких устанавливался на основании данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты, рентгенологического и томографического исследования легких, а так же молекулярно-генетических методов обследования.
Обследование больных туберкулезом легких проводили до начала противотуберкулезной химиотерапии и после окончания интенсивной фазы основного курса (через два месяца от начала этиотропной терапии). Первую группу (группа 1) составили больные очаговым и инфильтративным туберкулезом легких до начала противотуберкулезной химиотерапии (308 человек). Во вторую группу (группа 2) вошли больные очаговым и инфильтративным туберкулезом легких после проведения интенсивной фазы основного курса противотуберкулезной химиотерапии (308 человек).
Все больные получали противотуберкулезную терапию по 1 стандартному режиму, включающему изониазид, рифампицин, пиразинамид, этамбутол в стандартных дозировках в соответствии с массой тела больного [5].
Лекарственные препараты назначались перорально и парентерально. При развитии побочных реакций проводили дезинтоксикационную и корригирующую терапию.
Мононуклеары выделяли из венозной крови на градиенте плотности. Кровь для исследования забирали из периферической вены утром, до приема пищи. Липиды экстрагировали по Фолчу. Для более полной экстракции минорных фракций фосфолипидов использовали смесь хлороформ-метанол 1:2. Определение липидного спектра мембран иммуноцитов проводили методом проточной тонкослойной хроматографии [6]. Перед хроматографическим разделением очищенные экстракты концентрировали путём выпаривания в вакууме при температурах не выше +10 C. Это позволяло избежать взаимопревращение основных классов липидов in vitro. Полученные хроматограммы проявляли в парах серной кислоты и оцифровывали в отраженном свете [7].
В спектре общих липидов определяли общие фосфолипиды (ФЛ), свободный холестерин (СХ), свободные жирные кислоты (СЖК), триглицериды (ТГ), эфиры холестерина (ЭХ). В спектре фосфолипидов определяли следующие фракции: суммарные лизофосфолипиды (ЛФЛ), сфингомиелин (СМ), фосфатидилинозитол (ФИ), фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилсерин (ФС), фосфатидилэтаноламин (ФЭ).
Цифровые сканы хроматограмм обрабатывали денситометрически с использованием программного комплекса Хромоскан. Для расчета площади пиков с частичным наложением их друг на друга использовали аппроксимацию. Для определения процентного содержания липидов в каждой фракции площадь пика, соответствующего данной фракции делилась на сумму площади всех анализируемых пиков [6].
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программных средств Statistica 10 и Microsoft Excel. Для обработки полученных значений использовали среднее арифметическое (М), среднее квадратичное отклонение (сигма), а для нормально распределенных параметров ошибку среднего арифметического (м). Сравнение двух групп осуществляли с использованием T-критерия Стьюдента. Доверительные границы определялись по вероятности ошибочного суждения, при этом достоверной разница считалась при P<0,05[1].
Результаты исследования. Анализ полученных данных показал следующие особенности спектра общих липидов плазматических мембран. Уровень суммарных фосфолипидов у больных до лечения и после окончания интенсивной фазы не отличался и был достоверно ниже соответствующего показателя в группе здоровых добровольцев. Относительное содержание свободного холестерина напротив, было повышенным у больных туберкулезом до лечения и после окончания интенсивной фазы химиотерапии.
При этом значение данной фракции после лечения было достоверно выше (p<0,01) по сравнению с больными до начала лечения. Уровень свободных жирных кислот был наиболее низким после проведения курса химиотерапии, однако, у больных до начала лечения он так же был достоверно ниже (p<0,01) по сравнению с контрольной группой.
Изменение значений фракции триглицеридов у больных до начала химиотерапии и после её окончания имели разнонаправленный характер. Так до начала лечения показатель относительно содержания триглицеридов был достоверно выше нормы (p<0,01), а после лечения снижался и статистически не отличался от значений в контрольной группе (p>0,05).
Уровень эфиров холестерина до лечения и после проведения интенсивной фазы достоверно не отличался от показателей здоровых добровольцев (p>0,05), однако, до лечения его значение было достоверно ниже, чем в группе больных после химиотерапии (p<0,05).
Таблица 1. Спектр общих липидов плазматических мембран мононуклеаров
Примечания: P1 - достоверность различий показателей липидов контрольной группы по отношению к группе 1; P2 - достоверность различий показателей липидов контрольной группы по отношению к группе 2; P3 - достоверность различий показателей липидов группы 1 по отношению к группе 2.
При оценке соотношений фосфолипидных фракций мембран моноцитов у больных группы 1 и группы 2 были выявлены следующие особенности. Уровень суммарных лизофосфолипидов группы 1 не отличался от контрольной группы. Однако после проведения интенсивной фазы химиотерапии (группа 2) он резко повышался и был достоверно выше, чем контрольной группе и в группе 1.
Значения относительного содержания сфингомиелина в мембранах моноцитов было снижено, как до лечения, так и после лечения. Данный показатель достоверно не отличался в группах больных туберкулезом (p>0,05).
Показатель фракции фосфатидилинозитола у больных группы 1 до лечения был более чем в 2 раза выше, чем в контроле. После проведенного курса химиотерапии содержание ФИ в мембране моноцитов снижалось на 0,3%, различие не достоверно (p>0,05). Относительное содержание фосфатидилхолина у больных группы 1 было значительно ниже, чем у здоровых лиц.
После лечения данный показатель становился ещё ниже и отличался от контрольной группы на 9,8%. Уровень фосфатидилсерина в группе 1 был значительно ниже, чем в контроле (различие достоверное), в группе 2 наблюдалось некоторое увеличение этого показателя. Относительное содержание фосфатидилэтаноламина было сопоставимым у больных туберкулезом легких до лечения и после лечения и достоверно не отличалось в этих группах, но было достоверно выше, чем в контрольной группе.
Таблица 2. Спектр фосфолипидов плазматических мембран мононуклеаров
Примечания: P1 - достоверность различий показателей липидов контрольной группы по отношению к группе 1; P2 - достоверность различий показателей липидов контрольной группы по отношению к группе 2; P3 - достоверность различий показателей липидов группы 1 по отношению к группе 2.
Таким образом, у больных туберкулезом легких наблюдалось значительное отклонение липидного и фосфолипидного состава мембран мононуклеаров как до лечения, так и после проведенной химиотерапии. При этом изменения в относительном содержании ФЛ, СХ, СЖК, СМ, ФИ, ФХ, ФС и ФЭ носили однонаправленный характер, а изменения в относительном содержании ТГ, ЭХ и ЛФЛ разнонаправленный.
В группе больных до лечения норме соответствовали только показатели фракции ЭХ и ЛФЛ, а после интенсивной фазы химиотерапии ТГ и ЭХ. Такие изменения свидетельствуют о выраженной дезорганизации липидных мембран мононуклеаров.
У больных до лечения данные изменения обусловлены действием возбудителя, и после лечения ряд показателей возвращались к норме. Однако химиотерапия оказывает выраженный токсический эффект, проявляющийся нарушением соотношений важнейших классов липидов.
С одной стороны, это свидетельствует о снижении иммунологической реактивности организма вследствие химиотерапии туберкулеза, с другой, является маркером эффективности терапии, которая превысила 61% по признаку абацилирования в конце интенсивной фазы основного курса.
В этой связи использование патогенетической терапии, направленной на коррекцию нарушенного метаболизма липидов мембран иммунокомпетентный клеток, позволит повысить эффективность химиотерапии туберкулеза, улучшит общие результаты лечения.
Выводы
У больных туберкулезом легких до лечения имеются выраженные отклонения в липидном составе мембран мононуклеаров, что свидетельствует о нарушении функций важнейшего компонента противотуберкулёзного иммунитета.
В конце интенсивной фазы противотуберкулезной химиотерапии намечается тенденция к нормализации липидного соотношения в моноцитах.
Токсический эффект противотуберкулезных химиопрепаратов приводит к накоплению цитотоксичных фракции лизофосфолипидов на мембранах иммуноцитов, что ухудшает их функциональную активность, но является маркером эффективности терапии, которая в настоящем исследовании превысила 61% по признаку абацилирования.
Коррекция нарушенного метаболизма липидов мембран иммунокомпетентных клеток, позволит повысить эффективность химиотерапии туберкулеза.