Русский English

Мишланов В.Ю., Суханов С.Г., Владимирский В.Е., Половинкина Т.А.

Белоксинтезирующая и липидвысвобождающая способность лейкоцитов у больных ишемической болезнью сердца в ранний и отдаленный периоды после коронарного шунтирования

Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера

Введение. Сосудистые заболевания являются лидирующей причиной смертности во всем мире. По статическим данным, ежегодно фиксируется 4,35 млн. смертей в 53 странах-членах Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) Европейского региона и более 1,9 млн. смертей ежегодно в Европейском союзе. От сердечно-сосудистых заболеваний погибает экономически активная часть населения − люди трудоспособного возраста, имеющие профессиональный опыт, что наносит существенный урон экономике и социальной сфере. В основе патогенеза многих заболеваний сердечно-сосудистой системы, в т.ч. ишемической болезни сердца (ИБС), лежит атеросклероз, стенозирующий просвет коронарных артерий [1]. Для восстановления коронарного кровотока, наряду с другими методами реваскуляризации активно применяется коронарное шунтирование [2]. С целью оценки течения атеросклероза в послеоперационном периоде рекомендовано исследование концентрации С-реактивного протеина (СРП) в сыворотке крови [3]. Тем не менее, вопросы применения многих других маркеров течения послеоперационного периода больных, перенесших коронарное шунтирование, не изучались.

Липидвысвобождающая способность лейкоцитов (ЛВСЛ) представляет собой белок синтезирующую функцию, реализуемую в условиях тесного межклеточного контакта в тканях или in vitro, в результате которой синтезируются белки, связывающие холестерин, способные откладываться в интиме сосудистой стенки и других тканях. Метод определения липидвысвобождающей способности лейкоцитов представляет собой экспериментальную индивидуальную модель атеросклероза in vitro, в которой воспроизводится белок− синтезирующая способность нейтрофилов и оценивается количество общего холестерина в супернатанах 3-х суточных культур лейкоцитов, связанного синтезированными белками [4]. Величина ЛВСЛ коррелирует с некоторыми клиническими проявлениями ИБС, течением атеротромботического мозгового инсульта, и рассматривается авторами как независимый фактор риска развития атеросклероза и маркер активности атеросклеротического процесса. Доказано, что увеличение высвобождения белково-липидных комплексов in vitro сочетается с более выраженным атеросклерозом магистральных сосудов [5]. Величина ЛВСЛ и активность белоксинтезирующей функции нейтрофилов у больных в послеоперационном периоде ранее не изучались.

Целью работы являлось изучение патогенетического значения некоторых синтезируемых лейкоцитами воспалительных белков, и ЛВСЛ у больных с ИБС в раннем послеоперационном периоде.

Материалы методы. Набор пациентов проходил на базе кардиологического (гериартрического) отделения Городской клинической больницы №4, г. Пермь. Исследование ЛВСЛ выполнено на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории Пермской государственной медицинской академии им. акад. Е.А. Вагнера. Исследование было выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинской Декларации. Протокол исследования был одобрен Этическим комитетом участвующего клинического центра. До включения в исследование у всех участников было получено письменное информированное согласие.

Для достижения поставленной цели обследовано 30 пациентов, из которых сформировано 2 группы.

Первая группа – пациенты с ИБС (стенокардия напряжения II-III функционального класса - ФК) после операции коронарного шунтирования - КШ (n=15).

Вторая группа − контрольная, в которую вошли практически здоровые лица (n=15). Средний возраст больных первой группы составил – 61,5 год, от 40 до 75 лет, во второй – 50,5 лет, от 39 до 57 лет.

При формировании групп были введены следующие критерии исключения: сахарный диабет, нарушения толерантности к глюкозе, бронхиальная астма, хроническая обструктивная болезнь легких, кардиомиопатии, миокардиты, пороки сердца, нарушение функции щитовидной железы, острые воспалительные заболевания или обострения хронических респираторных заболеваний в течение 2-х недель до включения в группы исследования, значимые нарушения ритма сердца и проводимости. Критерии включении: пациенты с ИБС, обследованные в сроке 2 недель и более после коронарного шунтирования. В группе больных с ИБС у 10 (66,6%) из 15 пациентов имели в анамнезе инфаркт миокарда (ИМ), у трех (33,4%) из них ИМ был повторный. Все пациенты имели артериальную гипертензию III стадии, риск 4, 33 % больных (5 человек) имели хроническую сердечную недостаточность 2 функционального класса и 67% (10 человек) – хроническую сердечную недостаточность 3-го функционального класса. 13 пациентов (85,7%) из 15 имели стенокардию напряжения на уровне III ФК, 2 пациента соответственно (14,3%) нестабильную стенокардию. Среднее количество шунтов составило 2,5±1,7. Все шунты были венозные, у одной пациентки к тому же имелся венозный гомографт.

Дизайн исследования. Выполнено 3 этапа исследования (рис. 1).

1. Предоперационное обследование больных.

2. Обследование через 2 недели после операции КШ.

3. Обследование через 3 месяца после операции КШ.

Рис. 1. Дизайн исследования

Рис. 1. Дизайн исследования

На 1-м этапе обследование включало: сбор анамнеза (применялась анкета), объективное обследование пациентов, общие клинические методы обследования (общий анализ крови, мочи, определение концентрации глюкозы, общего белка, креатинина, активности трансаминаз в сыворотке крови; электрокардиография - ЭКГ, эхокардиография - ЭхоКГ).

На 2-м этапе выполнялись: анкетирование, осмотр пациентов, контрольные общие клинические исследования, а также специальные методы: определение ЛВСЛ, концентрации общего холестерина в сыворотке крови холестериноксидазным методом, с использованием стандартных наборов фирмы Human.

На 3-м этапе выполняли следующие специальные методы: анкетирование, определение общего холестерина, ЛВСЛ, концентрации липопротеина а - ЛП(а), СРП, и предшественника «мозгового» натриуретического пептида - proBNP в супернатанах 3-х суточной культуры нейтрофилов. Исследовали концентрацию СРП в сыворотке крови больных.

Все пациенты после коронарного шунтирования принимали стандартную терапию: препараты группы ингибиторов АПФ (иАПФ) (рамиприл 2.5 мг или эналаприл 10 мг в сутки или престариум 5 мг), бета-блокаторы (беталок ЗОК 50-100 мг в сутки), статины (аторвастатин 40 мг или крестор 20 мг в сутки), двойная антиагрегантная терапия (100 мг аспирин-кардио и 75 мг плавикс), диуретики.

С целью стандартизации метода опроса больных на всех этапах исследования применяли анкету, которая включала 19 вопросов. Анкета помогла определить относительные жалобы пациентов, оценить основные клинические проявления заболевания, анамнез развития симптомов и факторы риска.

Определение ЛВСЛ проводили согласно методу, предложенному А.В. Туевым и В.Ю. Мишлановым [6]. Метод осуществляли следующим образом. Исследовали образцы венозной крови. Кровь забирали из локтевой вены в количестве 10 мл в стерильную пробирку, содержащую раствор гепарина (500 ЕД). Клеточную суспензию, содержащую лейкоциты, выделяли методом отстаивания в растворе полиглюкина. Соотношение цельной венозной крови и раствора полиглюкина составляло 5:3. Клеточную суспензию дважды отмывали (однократно в физиологическом растворе натрия хлорида и однократно в среде Игла-МЕМ), ресуспендировали в культуральной среде, подсчитывали количество лейкоцитов и эритроцитов в камере Горяева, доводили концентрацию лейкоцитов до 50 000 в 1 мкл (количество эритроцитов не более 0,6-0,8 млн в 1 мкл) и помещали в стерильные флаконы по 0,4 мл. Инкубировали в течение 62 ч при 370 С. Определяли количество общего холестерина (ХС) в надсадочной жидкости холестериноксидазным методом с помощью наборов фирмы Human.

Для изучения белоксинтезирующей функции нейтрофилов, на 3 стуки культивирования в нейтрофильных супернатанах определялись концентрации ЛП(а) (набор фирмы Assa Pro), СРП (набор фирмы Biomerica), натриуретического пептида (proBNP) (набор фирмы Biomedica Slovakia) в супернатанах трехсуточных нейтрофильных культур методом иммуноферментного анализа (ИФА). Исследования выполнены в дублях. Данные, полученные в результате исследования, обрабатывали общепринятыми методами вариантной статистики с применением статистического программного пакета «Statistica 6.0». Количественные признаки, имеющих правильное распределение, представлены в виде М±σ. Оценка достоверности различий между группами наблюдения проводилась на основании определения критерия t Стьюдента для парных сравнений, непараметрического критерия Манна-Уитни. Достоверность различий устанавливалась при р<0,05. Корреляционный анализ осуществлялся методом Спирмена (R).

Результаты. Состояние больных ИБС в послеоперационном периоде характеризовалось удовлетворительным самочувствием. При этом, 3 человека (20%) предъявляли жалобы на небольшую слабость и головокружение при физической нагрузке; у 1 пациента (6,6%) возникали перебои в работе сердца. В 20% случаев (3 человека) пациенты жаловались на одышку, которая возникала при подъеме по лестнице на 2 этажа и более. Все пациенты принимали назначенные препараты (иАПФ, бета-блокаторы, антиагреганты, статины, диуретики). У 2 человек из 15 цифры артериального давления (АД) превысили 140/90 мм рт.ст, им была проведена коррекция терапии. Все пациенты сохраняли полную способность к самообслуживанию. Обращений за медицинской помощью по экстренным показаниям не было. В раннем послеоперационном периоде посткардиотомный синдром развился в послеоперационном периоде у 1 пациента (6,6%).

Таблица 1. Результаты показателей общего анализа крови у больных ИБС до и после оперативного лечения

Таблица 1. Результаты показателей общего анализа крови у больных ИБС до и после оперативного лечения

Примечание: здесь и далее р – определено методом сравнения двух групп по количественному признаку (критерий Манна-Уитни), жирным шрифтом выделены достоверные различия показателей в сравниваемых группах

Представленные в табл. 1 результаты обследования больных до и после операции свидетельствуют о наличии анемии легкой степени и нейтрофильного лейкоцитоза с достоверным повышением в послеоперационном периоде. Согласно дизайну исследования ЛВСЛ определялась в послеоперационном периоде. Через 2 недели после коронарного шунтирования ЛВСЛ составила 0,15±0,06 ммоль/л. Корреляционный анализ установил прямую взаимосвязь ЛВСЛ и количества установленных в процессе операции коронарных шунтов (r=0,32, p<0,050). Через 3 месяца – 0,12±0,04 ммоль/л, что соответствовало средней величине данного показателя в контрольной группе 0,12±0,02 ммоль/л. В 80% случаев (12 человек) значения показателя оставались в пределах нормы и лишь в 20% (3 человека) выявлено увеличение показателя. Белок синтезирующая функция нейтрофилов изучалась путем определения концентрации ЛП(а), СРП, proBNP в супернатанах трехсуточных нейтрофильных культур методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Выявлена достоверная разница между концентрацией СРП в супернатанах трехсуточных нейтрофильных культур у больных ИБС и здоровых лиц. У больных ИБС среднее значение составило 5,1± 3,4мкг/л, что в 3 раза выше, чем у здоровых – 1,88±2,1 мкг/л (p=0,04). Аналогичные различия выявлены между средними величинами концентраций СРП в сыворотке крови. У здоровых средняя концентрация СРП в крови составила 10,3± 10,3мкг/л, у больных ИБС – 44,7±42,7 мкг/л. Разница между группами близка к достоверной (p=0,05). Методом корреляционного анализа установлена прямая корреляционная связь между концентрацией СРБ в сыворотке и супернатанах трехсуточных нейтрофильных культур у обследованных больных ИБС (r=0,64, p=0,0020). У здоровых лиц установлена прямая взаимосвязь между уровнем липопротеина(а) в культуральной жидкости и показателем ЛВСЛ (r = 0,16, p<0,050). Выявлена достоверная разница между двумя группами по величине концентраций ЛП(а) и pro-BNP в супернатанах клеточных культур (табл. 2).

Таблица 2. Концентрации ЛП(а) и ProBNP в супернатанах нейтрофильных культур у больных с ИБС и контрольной группы (нг/мл)

Таблица 2. Концентрации ЛП(а) и ProBNP в супернатанах нейтрофильных культур у больных с ИБС и контрольной группы (нг/мл)

Обсуждение. Непременными участниками атеросклеротического процесса являются лейкоциты. Роль моноцитов, лимфоцитов достаточно хорошо изучена. Мало исследованной остается роль в процессах атерогенеза самой многочисленной фракции лейкоцитов – нейтрофилов. Не смотря на короткий период своей жизни, лейкоциты за счет своей многочисленности и функциональной активности составляют основную линию защиты человека против бактериальных агентов, участвуют в механизмах врожденного иммунитета. Среди многих механизмов противомикробной защиты, осуществляемой нейтрофилами, в последние годы активно изучается роль катионных пептидов, кининов, ангиотензин II и антимикробных протеинов (дефензины, лактоферрин и др.), синтезируемых нейтрофилами. Представляется вероятным активное участие различных белков и пептидов, синтезируемых нейтрофилами в процессах атерогенеза [9]. Результаты проведенного исследования указывают на увеличение ЛВСЛ сразу после коронарного шунтирования до 0,15 ммоль/л и нормализацию его в течение 3 месяцев послеоперационного периода у большинства обследованных больных ИБС (80% случаев). У 3-х больных (20%) отмечено увеличение ЛВСЛ в послеоперационном периоде. Согласно ранее проведенным исследованиям, стабильная форма ИБС не сопровождается увеличением ЛВСЛ больше 0,150 ммоль/л, в связи с чем, увеличение ЛВСЛ более 0,150 ммоль/л предложено использовать ЛВСЛ как критерий нестабильного течения ИБС [8].

Результаты проведенного исследования установили факт синтеза СРП нейтрофилами больных ИБС в послеоперационном периоде, выявлено увеличение концентрации СРП в сыворотке крови больных ИБС и культурах нейтрофилов по отношению к контрольной группе практически здоровых лиц. Следовательно, увеличение ЛВСЛ в раннем послеоперационном периоде и нормализация показателя в течение 3-х месячного периода наблюдения отражает роль воспалительной реакции. Высокое клиническое значение ЛП(а) при ИБС является известным фактом [10]. Результаты настоящего исследования показали, что при воспалительных процессах ЛП(а) высвобождается в культуре лейкоцитов in vitro, что подтверждает мнение о нестабильном течении заболевания в раннем послеоперационном периоде [4]. Изложенные результаты указывают на высокое прогностическое значение ЛВСЛ у больных с ИБС, после коронарного шунтирования. Величина ЛВСЛ, видимо, в большей степени зависит от количества белка, синтезируемого лейкоцитами, обладающего способностью образовывать белково-липидные комплексы [7,8]. Исследование выполнено с использованием средств гранта РФФИ №11-04-96021.

Выводы

1. Выявлено увеличение ЛВСЛ в послеоперационном периоде в 53,3% случаев. Через 3 месяца после операции коронарного шунтирования величина ЛВСЛ снижается и остается в пределах нормы в 80% случаев. В 20% выявлено увеличение показателя.

2. Величина ЛВСЛ напрямую зависит от количества шунтированных сосудов и активности воспалительной реакции организма в послеоперационном периоде.

3. Состав белково-липидных комплексов, освобождаемых нейтрофилами больных ИБС в условиях 3-суточного культивирования, включает СРП, ЛП(а), pro-BNP.

4. Концентрация СРП в сыворотке у пациентов ИБС достоверно выше, чем в контрольной группе.


Список использованных источников:

1. Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза. Российские рекомендации// Комитет экспертов Российского научного общества кардиологов. Секция атеросклероза. – М., 2004. – С. 5-11.

2. Пя Ю.В. Ближайшие и отдаленные результаты реваскуляризации миокарда у больных ишемической болезнью сердца и сахарным диабетом// Международный эндокринологический журнал. – 2010. – №8. – С .3.

3. Метод липидвысвобождающей способности лейкоцитов в диагностике механизмов атерогенеза у больных ишемической болезнью сердца и атеротромботическим вариантом мозгового инсульта/ В.Ю. Мишланов, А.В. Туев, А.А. Шутов// Клиническая и лабораторная диагностика. – 2006. - № 5. – С. 9-12.

4. Липидвысвобождающая способность лейкоцитов и провоспалительные биомаркеры у больных с сочетанным течением артериальной гипертензии и ишемической болезни сердца в зависимости от функционального класса хронической сердечной недостаточности/ В.Ю. Мишланов, В.Е. Владимирский, Л.И. Сыромятникова, Т.В. Бурцева, О.В. Харузина// Здоровье семьи 21 век.−2012.- №5.−С.12.

5. Климов А.Н., Никуличева Н.Г. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. - СПб.: Питер, 1999

6. Способ диагностики прогрессирующей стенокардии у больных ишемической болезнью сердца/ А.В. Туев, В.Ю. Мишланов. – Пат. на изобретение № 219495 РФ от 20.12.2002. - № 35. - С.8.

7. Титов В.Н., Осипов С.Г. Атеросклероз. Роль эндогенного воспалении, белков острой фазы и жирных кислот. - М., 2004.

8. Тепляков А.Т. Хроническая сердечная недостаточность: новые аспекты патогенеза, диагностики и вторичная профилактика// Коронарная и сердечная недостаточность: колл. моногр., посв. 25-летию НИИ кардиологии Томского научного центра СО РАМН/ Под общ. Ред. Р.С. Карпова. - Томск: STT, 2005. Гл. 4. С. 218-268.

9. Inflammation in Atherosclerosis/ P. Libby, P. M. Ridker, T. Hanssor et al.// J. of the American College of Card. 2009. - Vol.54. -P. 2129-2138.

10. Apolipoprotein (a) Isoforms and Vascular Risk/ S. Erqon, A. Thompson, E.D. Angelantonio et al. // J. of the American College of Card. 2010. - Vol.55. -P. 2160-2167.


30.04.2013 04:43:00