Морфо-функциональные особенности клеток гранулоцитарного и мегакариоцитарного рядов гемопоэза у больных хроническим миелолейкозом, получающих терапию иматинибом

Ростовский государственный медицинский университет, г. Ростов-на-Дону

Хронический миелолейкоз (ХМЛ) – клональное опухолевое заболевание кроветворной ткани, характеризующееся появлением в стволовой кроветворной клетке реципрокной транслокации t(9;22)(q34;q11.2), следствием чего является образование слитного гена BCR-ABL. Указанная хромосомная транслокация приводит к выработке патологического белка р210, являющегося онкопротеином и обладающего тирозинкиназной активностью. Клональность заболевания доказывает факт обнаружения филадельфийской хромосомы как в предшественниках нейтрофилов, так и в предшественниках эозинофилов, базофилов, моноцитов, макрофагов и в эритробластах, мегакариоцитах и даже предшественниках Т-лимфоцитов.

Использование специфических лекарственных препаратов таргетной терапии - специфических ингибиторов BCR-ABL тирозинкиназы, целенаправленно блокирующих повышенную пролиферативную активность лейкозных клеток, позволило достигать максимальную элиминацию опухолевого клона и коренным образом менять прогноз хронического миелолейкоза у большинства больных. Основным ингибитором тирозинкиназ, используемым в лечении больных ХМЛ, у нас в стране является иматиниб.

Различные признаки дисгемопоэза, проявляющиеся в функциональных нарушениях гемопоэтических клеток костного мозга и клеток периферической крови, чаще встречаются у больных ХМЛ в продвинутых стадиях заболевания (фазе акселерации или бластного криза) и могут определять неэффективность проводимой терапии и неблагоприятный прогноз заболевания [14,15]. Тем не менее, нет однозначного мнения – является ли миелодисплазия предфазой развития ХМЛ или признаки дисгемопоэза появляются в кроветворных клетках в процессе опухолевой трансформации под воздействием онкогенных факторов. В литературе встречаются упоминания о появлении неспецифических признаков миелодисплазии (гипосегментацию ядер гранулоцитов по типу аномалии Пельгера – Хюэта или наоборот гиперсегментированность ядер; мегакариоциты с разъединенными ядрами; микромегакариоциты; мегалобластоидные или макроцитарные формы эритроцитов и т.п.) у больных с так называемой «прелейкемией», впоследствие трансформировавшейся в острый или хронический миелолекоз [5]. Также есть немногочисленные данные о развитии вторичной миелодисплазии у больных ХМЛ, получающих в течение длительного времени терапию иматинибом [4, 9, 11]. Некоторые авторы считают, что появление признаков миелодисплазии обусловлено предшествующей противоопухолевой терапией, прежде всего бусульфаном и гидроксимочевиной [9].

Морфологические изменения гемопоэтических клеток характеризуется разнообразием, но не являются специфичными для хронического миелолейкоза и не отражают в полной мере процессы, происходящие в кроветворных клетках. Для оценки обменных процессов, протекающих в кроветворных клетках, а также выявления ранних признаков их дисфункции при ХМЛ более информативным является цитохимическое исследование костного мозга [2].

Цель исследования. В нашей работе проводилось цитохимическое исследование клеток гранулоцитарного и мегакариоцитарного рядов костного мозга больных ХМЛ. Для выявления признаков дисгемопоэза в клетках костного мозга на фоне терапии иматинибом, их связи с развитием цитопений в периферической крови, воспринимающихся как проявление гематологической токсичности препарата, влияние самого иматиниба на процессы созревания, дифференцировки и функционирования клеток гранулоцитарного и мегакариоцитарного ряда.

Материалы и методы. В исследование было включено 36 пациентов, наблюдавшихся в гематологическом отделении клиники Ростовского государственного медицинского университета с марта 2009 по апрель 2012 г. Группу обследуемых составили 17 мужчин и 19 женщин в возрасте от 23 до 85 лет (медиана возраста – 58 лет).

У всех пациентов диагноз ХМЛ был подтвержден цитогенетическим исследованием клеток костного мозга (обнаружение транслокации t(9;22)(q34;q11.2) и/или молекулярно-генетическим методом (обнаружение слитного гена BCR-ABL в клетках костного мозга или крови). Все обследуемые получали иматиниб в дозе от 400 до 800 мг. Медиана продолжительности приема иматиниба составила 18 мес. С целью изучения влияния некоторых фармакокинетических параметров на цитохимические показатели при терапии иматинибом проводили определение концентрации препарата в плазме крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с детекцией методом тандемной масс-спектрометрии. В работе определяли остаточную концентрацию иматиниба через 24 часа после последнего приема.

В качестве контроля было взято 69 человек в возрасте от 19 до 64 лет, у которых не было выявлено первичных заболеваний кроветворной системы.

При цитохимическом исследовании пользовались полуколичественной оценкой результатов, применяя принцип Астальди, основанный на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски. В зависимости от нее исследуемые клетки делили на 4 группы: с отрицательной реакцией (-), слабоположительной (+), положительной (++) и резко положительной (+++). Для количественного выражения результатов подсчитывали 100 клеток определенного вида, дифференцируя их по степени интенсивности окраски, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски суммировали и вычитали количество клеток без окраски, результат выражали в процентах. [1] Для более объективного суждения о содержании вещества в клетках использовали метод количественной оценки цитохимических реакций, предложенный L.Kaplow в 1955 г. [8] и модифицированный в 1957 г. G. Astaldi и L. Verga. [3] Интенсивность окраски клеток оценивалась на основании определения среднего цитохимического коэффициента L. Kaplow (СЦК). В гранулоцитарных клетках костного мозга изучались: содержание общих липидов по методу H. Shehan, G. Storry c докрашиванием по Лейшману [13], активности пероксидазы по методу Graham-Knoll [6], содержание углеводов (ШИК-реакция с использованием реактива Шиффа йодной кислоты) по методу J. МсМаnus [10], активности щелочной фосфатазы в зрелых гранулоцитах по методу Hayhoe F., Quaglino D. (1958) [7], модифицированного L. Kaplow в 1955 г. [8] Для выявления возможных нарушений созревания клеток гранулоцитарного ряда проводился раздельный подсчет среднего цитохимического коэффициента (СЦК) для незрелых клеток (миелоцитов) и зрелых (сегментоядерных нейтрофилов). В мегакариоцитах изучались: активность альфа-нафтилэстеразы по методу А. Pearse [12] и содержание углеводов (РАS-реакция) по методу J. МcМаnus [10].

Всем обследуемым выполняли исследования общего анализа крови. Фагоцитарная активность лейкоцитов оценивалась по НСТ-тесту: спонтанный и стимулированный фагоцитоз, коэффициент стимуляции.

Cтатистический анализ данных проводился методами описательной статистики и сравнения выборок (с использованием параметрических критериев), корреляционного анализа (коэффициент корреляции Спирмена). Уровень статистической значимости был принят равным 0,05. Все значения в тексте и таблицах представлены в виде среднего значения со стандартным отклонением (М±SD). Полученные данные сравнивались с таковыми в контрольной группе.

Результаты и обсуждение. Цитохимическая характеристика клеток гранулоцитарного ряда больных ХМЛ, получающих терапию иматинибом, представлена в табл. 1.

Таблица 1. Средний цитохимический коэффициент клеток гранулоцитарного ряда у больных ХМЛ, получающих терапию иматинибом

 Таблица 1. Средний цитохимический коэффициент клеток гранулоцитарного ряда у больных ХМЛ, получающих терапию иматинибом

При сопоставлении цитохимических показателей клеток гранулоцитарного ряда у больных ХМЛ с данными контрольной группы было отмечено снижение уровня гликогена и липидов в миелоцитах, снижение активности пероксидазы и щелочной фосфатазы и уровня гликогена в сегментоядерных нейтрофилах. Выявлено повышение содержания липидов в миелоцитах (СЦК 2,01±0,32), при этом в сегментоядерных нейтрофилах этот показатель был снижен (СЦК 2,33±0,27) по сравнению с показателями контрольной группы.

В норме клетки гранулоцитарного ряда дают положительную реакцию, усиливающуюся с увеличением зрелости клетки, поэтому окраску на липиды используют для оценки степени зрелости гранулоцитов. Выявленные нами изменения могут свидетельствовать о нарушении процессов созревания и дифференцировки гранулоцитов костного мозга. В пользу этого свидетельствует также снижение активности пероксидазы в сегментоядерных нейтрофилах (СЦК 2,17±0,21) при нормальных значениях в незрелых клетках (СЦК 2,19±0,21).

Пероксидазы определяют степень зрелости цитоплазмы гранулоцитов и функционирование пластинчатого комплекса Гольджи. Активность пероксидаз выявляется в клетках гранулоцитарного ряда, начиная с миелобласта, постепенно возрастает по мере дифференцировки гранулоцитов, достигая наибольшей интенсивности в сегментоядерных нейтрофилах. Снижение активности этого фермента в зрелых нейтрофилах может быть следствием нарушений, возникающих в ходе пролиферации и дифференцировки клеток-предшественниц гранулоцитарного ряда. При оценке содержания гликогена наблюдалось снижение этого показателя в незрелых клетках гранулоцитарного ряда (0,83±0,11) в сочетании с повышением его содержания в зрелых гранулоцитах (2,12±0,19). В норме по мере созревания гранулоцитов интенсивность окраски на гликоген (РАS-реакция) увеличивается. Поэтому полученные данные противоречат предположению о функциональной незрелости гранулоцитов, так как повышение гранул гликогена в сегментоядерных нейтрофилах свидетельствует о достаточной зрелости этих клеток. С другой стороны, возможно, имеет место дисбаланс между процессами метаболизма в гранулоцитах. Активность щелочной фосфатазы в нейтрофилах костного мозга больных ХМЛ была низкой (СЦК 0,18±0,22). Преобладали нейтрофилы с первой степенью активности.

Результаты сравнения цитохимических показателей клеток гранулоцитарного ряда больных ХМЛ, получающих терапию иматинибом, с данными контрольной группы представлена в табл. 2.

Таблица 2. Цитохимические показатели клеток костного мозга больных ХМЛ, получающих терапию иматинибом

Таблица 2. Цитохимические показатели клеток костного мозга больных ХМЛ, получающих терапию иматинибом

Примечание: * достоверные различия между нормальными значениями и показателями в группе обследуемых больных, р<0,05.

При сопоставлении цитохимических показателей клеток гранулоцитарного ряда костного мозга с их фагоцитарной активностью не выявлено значимой корреляции между содержанием пероксидазы и гликогена в незрелых и зрелых гранулоцитах и функцией фагоцитоза. Хотя, снижение активности пероксидазы, наблюдаемое в зрелых гранулоцитах, предполагает снижение эффективности процессов фагоцитоза. Показатели НСТ-спонтанного теста (106±26,5 у.е.) и показатели НСТ-стимулированного теста (162,8±33 у.е.) были повышены, однако, отмечалось снижение коэффициента стимуляции, Кстим, (1,56±0,19), что может свидетельствовать в пользу снижения адаптационных резервов нейтрофилов и формирования неполноценности фагоцитоза.

Однако, выявлена зависимость между содержанием липидов в сегментоядерных нейтрофилах и показателями спонтанного и стимулированного НСТ-теста. Несмотря на снижение уровня липидов в сегментоядерных нейтрофилах отмечалось повышение показателей спонтанного и стимулированного НСТ-теста (r=-0,47, r=-0,414 соответственно). Наблюдалась прямая корреляционная связь между снижением степени активности ЩФ в сегментоядерных нейтрофилах и уменьшением показателей спонтанного и стимулированного НСТ-теста. (r =+0,375, r =+0,356 соответственно).

Вероятно, повышение активности гликогена и снижение уровня липидов в сегментоядерных нейтрофилах носит компенсаторный характер, т.е. интенсификация обменных процессов компенсирует недостаточную функцию фагоцитоза.

Выявленные признаки дисгранулоцитопоэза у больных ХМЛ не коррелировали со степенью выраженности снижения абсолютного содержания нейтрофилов и уровнем лейкоцитов в периферической крови.

При анализе мегакариоцитарного звена гемопоэза было выявлено достоверное снижение уровня гликогена (СЦК 2,1±0,34) и альфа-нафтилацетатэстразы (СЦК 2,05±0,39) в мегакариоцитах. Учитывая то, что гликоген является одним из основных энергетических субстратов клеток организма, снижение его содержания в мегакариоцитах может говорить о снижении интенсивности обменных процессов. Наблюдаемые изменения свидетельствуют о функциональной неполноценности мегакариоцитарного звена гемопоэза.

При сопоставлении этих данных с уровнем тромбоцитов периферической крови нами выявлена прямая корреляционная связи между активностью гликогена и альфа-нафтилацетатэстразы в мегакариоцитах и уровнем тромбоцитов. (r=+0,79, r =+0,691 соответственно).

Для оценки влияния иматиниба на процессы созревания, дифференцировки и функционирования клеток гранулоцитарного и мегакариоцитарного ряда проведен корреляционный анализ между цитохимическими показателями и концентрацией иматиниба в сыворотке крови. Обнаружена только обратная корреляционная связь между содержанием гликогена в незрелых гранулоцитах и уровнем иматиниба в крови (r=-0,45). Можно предположить, что высокие концентрации иматиниба в сыворотке крови вызывают нарушение созревания клеток гранулоцитарного ряда. Однако, это не подтверждается значимыми корреляциями между показателями пероксидазы и липидов в гранулоцитах и концентрацией иматиниба.

Резюмируя вышеизложенное, можно сделать следующие выводы:

  1. Цитохимическая оценка процессов метаболизма, протекающих в клетках гранулоцитарного ряда костного мозга больных ХМЛ выявила нарушения функционального созревания клеток, характеризующиеся повышением содержания липидов в незрелых формах и снижением активности пероксидазы - в зрелых. Высокий уровень гликогена и сниженная активность пероксидазы и щелочной фосфатазы в зрелых нейтрофилах свидетельствуют об интенсификации обменных процессов, обеспечивающих фагоцитарную активность этих клеток, компенсирующую нарушение других функций.
  2. Выявленные признаки дисгранулоцитопоэза у больных ХМЛ не коррелировали со степенью выраженности снижения содержания лейкоцитов, в т.ч. абсолютного числа нейтрофилов, в периферической крови.
  3. У больных ХМЛ отмечалось достоверное снижение уровня гликогена и АНАЭ в мегакариоцитах костного мозга по сравнению с показателями контрольной группы. Выявленные признаки дисмегакариоцитопоэза коррелировали со степенью выраженности снижения уровня тромбоцитов периферической крови.
  4. Убедительных данных, свидетельствующих в пользу того, что иматиниб вызывает нарушение созревания и дифференцировки клеток гранулоцитарного и мегакариоцитарного ростков гемопоэза, не получено. Можно предполагать об исходно имеющихся гемопоэтических нарушениях, возможно миелодисплазии, у больных ХМЛ.

 

Список использованных источников:

  1. Бутенко З.А., Глузман Д.Ф. Цитохимия и электронная микроскопия клеток крови и кроветворных органов. - К.: «Наукова думка». 1974. 248 с.
  2. Луппа Х. Основы гистохимии. – М.: Мир. 1980. –334 с.
  3. Astaldi G., Verga L. The glycogen content of the cells of lymphatic leukemia// Acta haemat.-1957.-Vol. 17.-N 3.-P.129-134.
  4. Chee Y.L., Vickers M.A., Stevenson D., Holyoake T.L. et al. Fatal myelodysplastic syndrome developing during therapy with imatinib mesylate and characterised by the emergence of complex Philadelphia negative clones// Journal Leukemia. – 2003. - Vol.17. - P.634–635.
  5. Georgii A., Thiele J., Vykoupil K.-F. et al. Myeloid Dysplasia: the Histopathology of Preleukemia// Journal of Haematology and Blood Transfusion – 1981. - Vol. 26. – P. 34-37.
  6. Graham G.S., Knoll W. Peroxidase reaction for general differentiation// Sandoz Atlas of Haematology, ed. by E. Undritz, Sandoz Basle, 1973.
  7. Hayhoe F.G.J., Quaglino D. Cytochemical demonstration and measurement of leukocyte alkaline phosphatase activity in normal and pathological states by a modified Azo-Dyc Coupling Technique// British Journal of Hematology – 1959. – Vol. 4. – P. 375
  8. Kaplow L.S. A Histochemical Procedure for Localizing and Evaluating Leukocyte Alkaline Phosphatase Activity in Smears of Blood and Marrow// Journal Blood. – 1955. - Vol. 195510. – P.1023.
  9. Magalhães S.M.M., Duarte F.B., Ribeiro S.C.C., Borovik C.L. et al. Sideroblastic anemia following treatment of chronic myeloid leukemia with busulfan// Journal Leukemia. – 2000. - Vol. 14, № 1. – P. 214-215.
  10. McManus J.F.A. Histochemical Demonstration of Mucin after Periodic Acid// Journal Nature (London). – 1946. – Vol. 158. - P.202.
  11. Mozziconacci M.J., Caillères S., Maurice C. et al. Myelodysplastic features developing in Philadephia-negative cells during imatinib mesylate therapy for CML: report of a new case// Journal Leukemia. – 2003. - Vol. 17. - P. 1901–1902.
  12. Pearse A.G.E. Histochemistry, theoretical and applied - 1968, v. 1, Edinburg: Churchill Livingstone.
  13. Sheehan H.L., Storey G.W. An improved method of Staining Leukocyte Granules with Sudan Black B// Journal of Pathology and Bacteriology. – 1947. - Vol. 59, - P. 336.
  14. Matsuo T. et al. Prognostic significance of the morphological dysplastic changes in chronic myelogenous leukemia// Journal Leukemia Research. – 1986. - Vol. 10, Issue 3. – P. 331–337.
  15. Westfall E., Zhang L., Song S., Lee S.J. et al. Concurrent Megakaryocytic and Erythroid Chronic Myelogenous Leukemia Blast Crisis// Archives of Pathology and Laboratory Medicine. - 2008. - Vol. 132, № 6. - P. 1021-1025.