Русский English

Мартусевич А.К., Соловьева А.Г., Перетягин С.П., Диденко Н.В.

Анализ влияния оксида азота на физико-химические параметры крови in vitro

Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии

Введение. В настоящее время изучению эффективности применения физических факторов в хирургии и травматологии уделяется значительное внимание практических врачей и научной общественности. Одним из вариантов практической реализации подобных технологий является использование генератора холодной плазмы, содержащей монооксид азота, реализованный в настоящее время в форме аппарата «Плазон» [1-4]. Несмотря на проведенные ранее исследования, направленные на оценку эффективности указанной лечебной технологии на различных моделях, ее молекулярно-клеточные механизмы изучены недостаточно полно [2].

Рассматривая эффекты NO-терапии, проводимой с помощью аппарата «Плазон», следует выделить два основных компонента: непосредственно монооксид азота, обладающий целым рядом различных биологических эффектов [5-13], так и сама холодная плазма, являющаяся его носителем в газовой фазе. Согласно данным последних десятилетий, последняя также не служит инертным веществом для биологических объектов [14, 15]. В частности, установлено, что она способна приводить к уничтожению микроорганизмов на различных поверхностях [16, 17], хирургических инструментах [14, 18] и даже на бумажных конвертах [19]. С другой стороны, применение холодной плазмы может быть дополнительным методом оптимизации течения раневого процесса [1, 3, 20-22].

В свою очередь второй компонент лечебного воздействия – оксид азота – оказывает многогранное биологическое действие, являясь молекулярным биорегулятором во всех функциональных системах организма [5-7, 10]. В частности, некоторыми авторами в экспериментальных и клинических условиях установлена его саногенетическая активность для ран различной локализации и этиологии [1, 3, 4, 22].

В связи с этим, целью исследования служила оценка действия монооксида азота (NO) на цельную кровь здоровых доноров.

Материалы и методы. Изучен характер реакции цельной консервированной крови на воздействие холодной плазмы, насыщенной оксидом азота. Для этого производили непосредственный барботаж образцов крови (5 мл) газообразным агентом (суммарная доза оксида азота 80 мкг) в течение 2 минут [23]. Генерацию холодной плазмы, насыщенной оксидом азота (концентрация вещества в газовом потоке в выбранных условиях – 800 мкг/л) выполняли аппаратом «Плазон» (Россия). Экспозиция после воздействия составляла 3 минуты. Контролем выступал образец, на который не оказывали никаких воздействий. Эксперимент повторяли десятикратно.

В донорской консервированной крови спектрофотометрическим методом определяли активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в прямой и обратной реакциях по методу Г.А. Кочетова, альдегиддегидрогеназы (АлДГ) – по методу Б.М. Кершенгольца, Е.В. Серкиной. Активность супероксиддисмутазы (СОД) оценивали по Т.В. Сироте. Содержание белка уточняли по модифицированному методу Лоури. Уровень лактата в плазме крови и эритроцитах определяли с помощью анализатора SuperGL Ambulance. Показатели кислотно-щелочного равновесия и парциальное давление газов крови устанавливали с помощью автоматического анализатора ABL-77.

Результаты обрабатывали с использованием программы Statistica 6.0.

Результаты и обсуждение. Проведенные эксперименты позволили установить, что нитроксилирование крови газовым потоком, генерируемым аппаратом «Плазон», существенно изменяет уровень оцениваемых показателей. Так, рассматриваемый физический фактор оказывал значимое влияние на функционирование большинства ферментных систем (рис. 1). Так, в частности, установлено статистически значимое снижение активности ЛДГ в прямой реакции (на 39 и 15% соответственно; p<0,05) на фоне повышения активности последнего энзима в обратной реакции (на 86%; p<0,05). Выявленные сдвиги косвенно свидетельствует о снижении энергетических ресурсов эритроцитов.

К адаптивным NO-индуцированным изменениям также следует, на наш взгляд, отнести выраженное снижение активности одного из основных компонентов ферментного звена антиоксидантной системы крови – супероксиддисмутазы (на 39% относительно контрольного уровня; p<0,05). С учетом того, что действие на биологическую среду холодной плазмы и NO сопряжено с гиперпродукцией в ней свободных радикалов [20], данная тенденция может отражать нейтрализацию последних изучаемым энзимом и иметь компенсаторное значение.

Рис. 1. Влияние газообразного оксида азота на активность ферментных систем крови (ЛДГпр и ЛДГобр – прямая и обратная реакции лактатдегидрогеназы соответственно, АлДГ – альдегиддегидрогеназа, СОД - супероксиддисмутаза)

Рис. 1. Влияние газообразного оксида азота на активность ферментных систем крови (ЛДГпр и ЛДГобр – прямая и обратная реакции лактатдегидрогеназы соответственно, АлДГ – альдегиддегидрогеназа, СОД - супероксиддисмутаза)

Рис. 2. Уровень лактата плазмы крови и эритроцитов при воздействии оксидом азота

Рис. 2. Уровень лактата плазмы крови и эритроцитов при воздействии оксидом азота

NO-зависимые метаболические перестройки, в частности приводящие к нарушению физиологического функционирования ЛДГ в эритроцитах со смещением в сторону активации обратной реакции обуславливают разнонаправленную динамику концентрации лактата в плазме и эритроцитах (рис. 2). Так, в первом биообъекте (плазме крови) регистрировали минимальное снижение содержания исследуемого метаболита (на 6%), тогда как во втором – четкую тенденцию к нарастанию (на 11%; p<0,05). С наших позиций, выявленные сдвиги активности ЛДГ и лактата эритроцитов могут рассматриваться как предпосылки гипоксического состояния, смоделированного in vitro при действии высоких доз оксида азота на цельную кровь здоровых людей.

Также представляют интерес данные, касающиеся динамики парциального давления углекислого газа и кислорода в крови при ее нитроксилировании газовым потоком, генерируемым аппаратом «Плазон» (рис. 3). Выявленные изменение активности ЛДГ в прямой и обратной реакциях и нарастание уровня лактата в эритроцитах, указывающие на формирование энергодефицита, предположительно должны были сочетаться с падением парциального давления кислорода в крови, однако нами зарегистрирована противоположная тенденция – увеличение значения данного показателя на 107%. Подобная картина, по нашему мнению, связана не с самим оксидом азота, а с особенностями «носителя» газовой фазы – холодной плазмы, которая содержит в себе значительное количество молекулярного кислорода в метастабильном состоянии и атомарного кислорода [14, 20, 21]. Растворение последних и обеспечивало наблюдаемый в эксперименте эффект гипероксигенации, сочетающейся со снижением парциального давления углекислого газа.

Рис. 3. Парциальное давление кислорода и углекислого газа в крови при ее обработке оксидом азота

Рис. 3. Парциальное давление кислорода и углекислого газа в крови при ее обработке оксидом азота

Кроме того, установлено, что нитроксилирование крови приводило к минимальному закислению среды (ΔpH=–0,08), снижению уровня биокарбонатов плазмы (на 44% относительно исходного уровня; p<0,05) и повышению уровня калия в ней (ΔК+=0,43 ммоль/л). Важно подчеркнуть, что при обработке образцов цельной крови монооксидом азота визуально наблюдается эффект «потемнения», который может быть обусловлен метгемоглобинообразованием.

Заключение. Таким образом, обработка цельной крови здоровых доноров холодной плазмой, содержащей высокие концентрации оксида азота, способствовала ряду сдвигов энергетического метаболизма, ионного состава и кислотно-щелочного равновесия в биологическом субстрате. Кроме того, нитроксилирование крови в использованном режиме, оказывая преимущественное влияние на состояние эритроцитов, демонстрирует признаки метгемоглобинообразования. Оценка характера действия данного фактора на биосистемы, а также уточнение эффективных и безопасных доз оксида азота позволят более подробно расшифровать механизмы его эффекта и оптимизировать применение изучаемого аппарата.


Список использованных источников:

1. Ефименко Н.А. с соавт. Воздушно-плазменные потоки и NO-терапия – новая технология в клинической практике военных лечебно-профилактических учреждений// Военно-мед. журнал. 2005. (5). 51-54.

2. Лапитан Д.Г. с соавт. Медико-физические аспекты стимуляции микроциркуляции крови оксидом азота при лечении заболеваний ЛОР-органов// Медицинская физика. 2012. (1). 61-68.

3. Липатов К.В., Сопромадзе М.А., Шехтер А.Б. с соавт. Применение газового потока, содержащего оксид азота (NO-терапия) в комплексном лечении гнойных ран// Хирургия. 2002. (2). 41-43.

4. Shekhter A.B., Serezhenkov V.A., Rudenko T.G. et al. Beneficial effect of gaseous nitric oxide on the healing of skin wounds// Nitric oxide. 2005. 12. 210-219.

5. Ванин А.Ф. Оксид азота в биомедицинских исследованиях// Вестник Российской Академии медицинских наук. 2000. (4). 3-5.

6. Ванин А.Ф., Писаренко О.И., Студнева И.М. с соавт. Действие динитрозильного комплекса железа на метаболизм и клеточные мембраны ишемизированного сердца крысы// Кардиология. 2009. (12). 43-49.

7. Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарств. - М.: Вузовская книга. 2004. 360 с.

8. Brune B., Hanstein K. Rapid reversibility of nitric oxide induced platelet inhibition// Thrombosis Research. 1998. 90. 83-91.

9. Mathisen D.J., Kuo E.Y., Hahn C. et al. Inhaled nitric oxide for adult respiratory distress syndrome after pulmonary resection// The Annals of Thoracic Surgery. 1998. 66. 1894-1902.

10. Nitric Oxide. Basic Research and Clinical Application/ Ed. R.J. Gryglewsky, P. Minuz. - Amsterdam; Washington: IOS Press. 2001.

11. Nong Z., Hoylaerts M., Van Pelt N. et al. Nitric oxide inhalation inhibits platelet aggregation and platelet-mediated pulmonary thrombosis in rats// Circulation Research. 1997. 81. 865-869.

12. Ricciardi M.J., Knight B.P., Martinez F.J., Rubenfire M. Inhaled nitric oxide in primary hypertension: A safe and effective agent for predicting response to nifedipine// Journal of the American College of Cardiology. 1998. 32. 1068-1073.

13. Weber A., Strobach H., Schror K. Direct inhibition of platelet function by organic nitrates via nitric oxide formation// European Journal of Pharmacology. 1993. 247. 29-37.

14. Chen C.Y., Fan H.W., Kuo S.P. et al. Blood clotting by low temperature air plasma// IEEE Trans. on Plasma Science. 2009. 37. 993-999.

15. Gries A., Bode C., Peter K. et al. Inhaled nitric oxide inhibits human platelet aggregation, p-selectin expression, and fibrinogen binding in vitro and in vivo// Circulation. 1998. 97. 1481-1487.

16. Duarte S., Kuo S.P., Murata R.M. et al. Air plasma effect on dental disinfection// Physics of Plasmasю 2011.18. 073503. 1-7.

17. Lai W., Lai H., Kuo S.P. et al. Decontamination of biological warfare agents by a microwave plasma torch// Physics of Plasmas. 2005. (12). 023501- 023506.

18. Baxter H.C., Campbell G.A., Whittaker A.G. et al. Elimination of TSE infectivity and decontamination of surgical instruments using RF gas-plasma treatment// Journal of General Virology. 2005. 86. 2393-2399.

19. Kuo S.P., Tarasenko O., Popovic S., Levon K. Killing of bacterial spores contained in a paper envelope by a microwave plasma torch// IEEE Transactions on Plasma Science. 2006. 34. 1275-1280.

20. Kuo S.P. Air plasma for medical applications// J. Biomedical Science and Engineering. 2012. (5). 481-495.

21. Kuo S., Chen C.Y. Lin, C.S., Chiang, S.H. Wound bleeding control by low temperature air plasma// IEEE Transactions on Plasma Science. 2010. 38. 1908-1914.

22. Kuo S.P., Chen C.Y., Lin C.S., Chiang, S.H. Applications of air plasma for wound bleeding control and healing// IEEE Transactions on Plasma Science. 2012. 40. 1117-1123.

23. Мартусевич А.К., Перетягин С.П., Иванникова Е.В. Физико-химические свойства физиологического раствора при действии активных форм кислорода и азота// Фундаментальные исследования. 2012. (11). 197-201.


01.04.2013 22:56:00