Согласно современной концепции профилактической медицины, актуальным является максимально раннее формирование групп женщин с высоким риском развития осложнений беременности на этапе доклинического течения заболевания. Ряд маркеров, используемых в биохимическом скрининге, продуцируются цитотрофобластом, а изменение их синтеза на этапах ранней плацентации может свидетельствовать о нарушении процессов формирования и развития плаценты и, следовательно, служить ранним прогностическим маркером возможного развития таких осложнений беременности, как фетоплацентарная недостаточность (ФПН), гестоз, преждевременные роды [2, 3, 5, 7]. Скрининговое исследование беременных регламентировано приказом Министерства Здравоохранения РФ № 1376 от 2010 г. и приказом департамента здравоохранения г. Москвы № 144 от 04.04.2005. На данном этапе развития науки, биохимическое скрининговое исследование позволяет выявить только пациенток с высоким риском рождения детей с хромосомной патологией. Что касается прогнозирования других осложнений беременности, накоплен достаточный объем знаний, требующий уточнения и систематизации для формулирования и разработки четких прогностических критериев развития акушерских осложнений [1, 4, 6].
В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования явилась оптимизация перинатальных исходов путем разработки и совершенствования способов ранней диагностики и прогнозирования плацентарной недостаточности по данным биохимического скрининга I триместра.
Материалы исследования. Было проведено проспективное когортное исследование охватившее 100 наблюдений. Критериями включения пациенток были низкие титры экспрессии РАРР-А (ассоциированный с беременностью плазменный протеин А) по данным биохимического скрининга I триместра (0,37±0,3 МоМ), одноплодная беременность, отсутствие подтвержденных хромосомных отклонений и пороков развития у плода и значимой соматической патологии у женщины. Возраст беременных был от 21 до 42 лет (30,1±2,3 лет). 46% женщин находились в возрасте от 21 до 30 лет.
В структуре экстрагенитальных заболеваний существенное место занимала патология сердечно-сосудистой системы и органов пищеварения (49% и 32%). Заболевания почек и мочевыводящих путей диагностировано у 10% пациенток и представлено хроническим пиелонефритом (6%) и мочекаменной болезнью (4%). 90% беременных в анамнезе имели различные гинекологические заболевания, наиболее распространенными среди них были патология шейки матки (67%) и кандидозный кольпит (72%). Хронический сальпингоофорит выявлялся в каждом 5-м наблюдении, а среди инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), преобладал хламидиоз (9%).
Большинство пациенток были повторнобеременными (58%), но первородящими (65,5%). Акушерский анамнез у повторнобеременных был отягощен за счет искусственных (25%) и самопроизвольных (5%) абортов. Физиологическими родами закончилась предыдущая беременность у 18% обследованных, кесарево сечение было проведено 3%.
Методы исследования. Иммунохимическое исследование проводили в лаборатории биокатализа на базе Института биоорганической химии им. Ю.А. Овчинникова и М.М. Шемякина. Использовали стандартные наборы реактивов фирмы R&S System (DPG00) для свободного PlGF (плацентарный фактор роста) человека. Измерение оптической плотности производили с помощью плашечного ридера «TECAN» (Австрия) при длине волны 450 нм. Патоморфологическое исследование проводили на базе 2-го патологоанатомического отделения ФГУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И.Кулакова. Для морфологического исследования из центральной части плаценты вырезали кусочки ткани размером 1,5х1,5х0,5 см и фиксировали в 10% нейтральном формалине. Гистологическое исследование проводили на парафиновых срезах толщиной 4-5 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином. Полуколичественно оценивалась выраженность компенсаторно-приспособительных (синцитиальные узелки, синцитио-капиллярные мембраны) и инволютивно-дистрофических процессов (отложения периворсинчатого фибриноида, солей кальция), а также степень отека ворсин. Иммуногистохимическое исследование проводили по стандартной методике с использованием готовых к применению поликлональных кроличьих антител VEGF (фактор роста сосудистого эндотелия) и полимерной системы детекции производства Spring Bioscience (США). Предварительную демаскировку антигена проводили путем кипячения образцов в растворе цитратного буфера с pH 6.0. Блокирование эндогенной пероксидазы - путем обработки срезов 0,3% раствора перекиси водорода в течение 15 мин. Статистическую оценку количественных данных проводили при помощи ЭВМ с использованием программного пакета «Statistica 6.0».
Результаты исследования. Для определения связи между низкой продукцией РАРР-А в I триместре и развитием осложнений беременности были отобраны 100 пациенток в сроке от 10 до 14 недель. В табл. 1 представлены результаты биохимического скрининга I триместра.
Таблица 1. Показатели биохимического скрининга I триместра (n=100)
В отобранную совокупность вошли только беременные женщины, у которых хромосомная патология у плода была исключена амнио- или кордоцентезом. Особенности течения беременности у них представлены в табл. 2.
Таблица 2. Особенности течения беременности
Среди осложнений I триместра преобладали ранний токсикоз (43%) и угроза прерывания беременности (22%). Во II триместре раннее развитие гестоза было зафиксировано у 6%, угроза прерывания беременности у 21%, нарушение маточно-плацентарного кровотока (МПК) у 19%. В III триместре гестоз и нарушение МПК выявлялись в 21 и 22% случаев, а угроза преждевременных родов была диагностирована у каждой 4-й женщины.
Из всех беременных с низкой продукцией РАРР-А в I триместре в 10% случаев в сроке от 18 до 24 недель был диагностирован синдром задержки роста плода (СЗРП) по асимметричному или смешанному типу, а в 19% - нарушение МПК различной степени выраженности. После выявления нарушений МПК и СЗРП все беременные были госпитализированы для проведения стандартной терапии, направленной на улучшение МПК и метаболических процессов (пентоксифиллин, актовегин, карнитин).
В III триместре у пациенток с ранним нарушением МПК развитие гестоза выявлено у каждой 5-й беременной (21%), СЗРП по асимметричному или смешанному типу в 19% случаев. Из 19 пациенток с нарушением МПК к 30-32 неделе у 8 (41,1%) отмечалась нормализация показателей кровотока, из них у 7 с нарушением МПК IА степени и 1 (5,26%) с нарушением МПК IБ степени. У 11 пациенток не смотря на проведенную терапию сохранялись изменения МПК, у 5 (26,31%) беременных они прогрессировали до IБ степени. В III триместре количество пациенток с нарушением МПК увеличилось за счет вновь выявленных случаев (n=11). У одной женщины было диагностировано нарушение МПК III степени в сроке 34 недели беременности на фоне тяжелого гестоза. Женщина была родоразрешена в экстренном порядке путем операции кесарево сечение.
У 19 женщин был диагностирован СЗРП, при этом у 8 (42,10%) из них данное осложнение сочеталось с нарушением МПК различной степени выраженности. Среди плодов с СЗРП преобладала асимметричная форма (52,63%) и наиболее часто выявлялась 1 степень отставания темпов роста.
Из 100 женщин с низким титром РАРР-А гестоз во II триместре развился у 6%, а в III триместре у 21%. Из них по шкале Савельевой Г.М., у 10 (47,61%) гестоз имел легкое течение, у 7 (33,34%) средней тяжести, а у 4 (19,04%) – тяжелое течение. Ранее начало гестоза было выявлено у 6 пациенток. Из них, в 3-х случаях гестоз манифестировал в 24 недели с повышения АД до цифр 140/90 мм рт. ст., у 3 пациенток – с патологической прибавки веса и отеков (с 25-27 недель беременности). Протеинурия отмечалась у 14 пациенток. Среднее количество теряемого с мочой белка составило 0,7±0,3 г/л. Гипертензия была диагностирована у 13 женщин и являлась ведущим симптомом гестоза. В III триместре беременности у пациенток с гестозом отмечалось более частое, по сравнению со среднепопуляционными показателями, нарушение МПК (85,71%), что свидетельствует об общности патогенетических механизмов развития данных осложнений. СЗРП выявлялся в 71,42% (n=15) случаев, а среди плодов преобладала асимметричная форма задержки роста I-II степени.
Нарушение маточно-плацентарного и плодово-плацентарного кровотока регистрировались в 100% случаев среди пациенток с гестозом тяжелого течения, в 66,66% при гестозе средней степени тяжести и в 57,14% при легком гестозе.
Преждевременно (на 35-37 неделе) роды закончились у 21 пациентки. Кесарево сечение было произведено 31 женщине в связи с миопией высокой степени с изменением на глазном дне (n=3), тяжелым гестозом (n=4), смешанным ягодичным предлежанием плода (n=5), наличием рубца на матке (n=3), преждевременной отслойкой плаценты (n=2), патологическим типом КТГ (n=2) и острой гипоксией плода в родах (n=7). Новорожденные имели массу тела от 2330 до 3951г (2990+/-190г), рост от 43 до 54 см (49+/-1,5), среднюю оценку по шкале Апгар 8/8 баллов.
Только у 15% женщин с низкой продукцией РАРР-А в дальнейшем течение беременности не имело осложнений. У 75% были выявлены гестоз, фетоплацентарная недостаточность (СЗРП, нарушение МПК) и угроза преждевременных родов. С целью уточнения риска развития осложнений беременности мы оценили особенности течения беременности и перинатальные исходы в зависимости от выявленных отклонений. Пациентки были разделены на группу с СЗРП и группу без данного осложнения (табл. 3). Полученные результаты демонстрируют, что риск развития гестоза в 7 раз выше, риск нарушений МПК в 9 раз выше, риск преждевременных родов почти в 3 раза выше в случае сочетания низкой продукции РАРР-А в I триместре и развитием СЗРП во II триместре.
Таблица 3. Осложнения беременности и перинатальные исходы у пациенток с СЗРП
Результаты иммуноферментного анализа. По мере прогрессирования осложнений беременности у пациенток отмечалось снижение продукции PlGF с 372±15 пг/мл во II триместре до 200±13 пг/мл в III триместре (табл. 4).
Таблица 4. Продукция PlGF у пациенток с СЗРП и нарушением маточно-плодово-плацентарного кровообращения (НМППК) во II и III триместрах, M ± m
Примечания: p < 0,005 связь достоверна, при p > 0,05 связь недостоверна.
В табл. 5 представлены средние концентрации PlGF у женщин с сочетанием различных осложнений беременности. Выявлено, что при развитии тяжелых осложнений беременности, таких как гестоз, СЗРП и нарушение МПК продукция PlGF уменьшается в 3 раза по сравнению с нормативными показателями. Наиболее выраженные изменения концентрации PlGF наблюдались у пациенток с сочетанием тяжелого гестоза и СЗРП.
Таблица 5. Продукция PlGF у беременных с сочетанной акушерской патологией, M ± m
Для выявления связи между уровнями изучаемого фактора и клиническими данными был проведен корреляционный анализ с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена (rs).
Для PlGF и времени нарушения МПК выявлена прямая высоко достоверная связь (rs=0,91): чем раньше появляется нарушение МПК, тем ниже концентрация PlGF, обратная высоко достоверная корреляционная связь между концентрацией PlGF и выраженностью СЗРП (rs=-0,793) и нарушения МПК (rs=-0,712). Кроме того, была выявлена прямая высоко достоверная корреляция (rs=0,59) между продукцией PlGF и перинатальными исходами. Чем ниже концентрация PlGF в сыворотке крови матери, тем хуже показатели состояния новорожденного (снижена оценка по шкале Апгар, гипотрофия, гипоксически-ишемическое поражение ЦНС).
Таким образом, было выявлено, что у беременных с нарушением МПК и СЗРП достоверно снижена продукция PlGF, а степень изменения концентрации PlGF коррелирует с тяжестью акушерских осложнений и перинатальными исходами. При уровне PlGF выше 360±18 пг/мл можно ожидать благоприятные исходы беременности и родов.
Результаты морфологического исследования. Средняя масса плацент у пациенток с низкой продукцией РАРР-А составила 459+/-141 г (от 370 до 630 г). В результате гистологического исследования после окрашивания гематоксилин-эозином в 27 случаях были выявлены признаки преждевременного созревания плаценты с облитерационной ангиопатией и массивными участками вторичных изменений (отложение солей кальция, соединительнотканное перерождение стромы), соответствующих хронической субкомпенсированной форме плацентарной недостаточности. Только в 5 плацентах отмечалось соответствие созревания ворсинчатого дерева сроку гестации, в 7 плацентах выявлено отставание от гестационного срока на 2-4 недели. При этом во всех наблюдениях плацент выявлялся выраженный отек стромы ворсин различной степени выраженности и широкое межворсинчатое пространство. Основную массу ворсинчатого дерева представляли ворсины крупного диаметра с небольшим числом капилляров, что свидетельствует о преобладании процессов ангиогенеза без ветвления сосудов.
Использование иммуногистохимического метода позволило выявить особенности распределения VEGF в структурах плаценты. Максимальный уровень его экспрессии наблюдается в синцитиотрофобласте ворсин, в элементах вневорсинчатого цитотрофобласта и базальной пластинки. В элементах синцитиотрофобласта (СЦТ) терминальных ворсин отмечается снижение уровня экспрессии VEGF на 25,1%. В базальной пластинке и вневорсинчатом трофобласте наблюдается повышение интенсивности реакции. Установлено прогрессирующее снижение уровня экспрессии с увеличением степени выраженности акушерских осложнений, а в эндотелии капилляров терминальных ворсин, напротив, увеличение интенсивности реакции при наличии осложнений. Наряду с этим, в мезенхимальных клетках стволовых и терминальных ворсин отмечается повышение уровня экспрессии VEGF. Наиболее выраженный подъем (в 3 раза по сравнению с контролем) активности VEGF зафиксирован нами в гладкомышечных клетках стенки сосудов стволовых ворсин. Установлено снижение интенсивности реакции VEGF в СЦТ и эндотелии сосудов стволовых ворсин (на 9% и 16,8% соответственно) и более высокие уровни его экспрессии во вневорсинчатом цитотрофобласте и эндотелиоцитах капилляров терминальных и зрелых промежуточных ворсин (на 15,2% и 38,0% соответственно, р<0,05). В результате максимальный уровень экспрессии VEGF в плацентах от пациенток с низкой продукцией РАРР-А отмечается в элементах вневорсинчатого цитотрофобласта.
В условиях умеренной гипоксии экспрессия VEGF вызывает гиперкапилляризацию промежуточных ворсин по классическому механизму обратной связи, что сопровождается выраженной экспрессией VEGF в эндотелиальных клетках сосудов и преобладание ангиогенеза без ветвления сосудов. Подобные изменения, видимо, обусловлены влиянием факторов и механизмов, препятствующих связыванию VEGF с его рецептором и соответственно ингибирующих процессы ангиогенеза с ветвлением, характерные для физиологического развития плаценты.
Выявленные особенности иммуногистохимического распределения экспрессии VEGF и в ткани плаценты женщин с изначально низкой продукцией РАРР-А, отражают процессы компенсации и нарушения функционирования системы мать-плацента-плод в условиях формирующейся гипоксии.
Таким образом, проведенное нами исследование показало, что низкая продукция РАРР-А в I триместре может служить прогностическим критерием, позволяющим отнести беременных в группу риска по развитию гестоза, фетоплацентарной недостаточности и преждевременных родов.
Продукция плацентарного фактора PlGF роста снижена у пациенток с низкой продукцией РАРР-А и коррелирует со степенью выраженности акушерских осложнений.
В плацентах пациенток с низкой продукцией РАРР-А отмечается снижение экспрессии сосудисто-эндотелиального фактора роста VEGF и нарушение процессов васкуло- и ангиогенеза.