Актуальность. Проблема папилламатоза гортани (ПГ) у детей остается одной из самых актуальных в современной оториноларингологии [1-3]. Значимость проблемы связана с тем, что, поражая гортань, папилломатозный рост приводит к сужению ее просвета, нарушению жизненно важной функции – дыхательной, а также голосообразования. Этиологическим фактором ПГ считается человеческий папилломатозный вирус (HPV) –представитель семейства папавовирусов. Хотя, наличие специфического вируса считается основной причиной развития ПГ, однако одного присутствия вируса для развития болезни недостаточно [3, 7].
Известно, что поддержание гомеостаза, в частности, контроль за пролиферирующими и вирусинфицированными клетками осуществляется системой иммунобиологической реактивности, факторами неспецифической и специфической защиты [4-6]. Следовательно, дефекты последних (первичной и вторичной природы) отражаются на жизнедеятельности вирусов и динамике пролиферативного роста. С другой стороны, указанные процессы, по-видимому, сами могут приводить к формированию иммунодефицитных состояний.
Таким образом, исследование иммунного статуса организма при ПГ представляется целесообразным и может иметь практическую значимость.
Исходя из вышеизложенного, целью исследования явилось изучить характер и значимость нарушений иммунного статуса у детей с редко и часто рецидивирующим папилломатозом гортани.
Материал и методы. Нами было изучено и оценено патогенетическое значение изменений показателей иммунной системы в периферической крови у 54 больных детей школьного возраста с редко и часто рецидивирующим папилломатозом гортани, которые, были разделены на 2 репрезентативные группы: I группа – 35 больных с редко рецидивирующим папилломатозом гортани (РРПГ); II группа - 19 больных с часто рецидивирующим папилломатозом гортани (ЧРПГ). Контрольную группу составили 17 практически здоровых детей сопоставимого возраста.
Фенотипирование лимфоцитов проводили с помошью моноклональных антител CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD19+, CD25+ и CD95+ (производство ООО Сорбент, РФ, Москва). Концентрация иммуноглобулинов классов A,M,G определялась методом радиальной иммунодиффузии по Манчини (1964) с использованием моноспецифических антисывороток НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи. Определение уровня сывороточных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-4 и γ-ИНФ ) проводили с помощью тест-систем ООО «Протеиновый контур» и «Цитокин» (СПб, Россия) методом ИФА. Чувствительность метода 5-30 пг/мл.
Математическую обработку данных проводили методами вариационной статистики с помощью стандартных математических пакетов прикладных программ с определением средней, ее ошибки, критерия t Стьюдента.
Результаты и их обсуждение. Результаты исследований показали, что у детей дошкольного возраста при РРПГ дооперационном периоде обнаружились изменения некоторых параметров иммунной системы по сравнению с показателями контрольной группы (здоровых). На фоне нормальных количеств лейкоцитов и лимфоцитов было выявлено, что в периферической крови у детей с РРПГ относительное количество Т-лимфоцитов составил – 50,8±1,12%, что достоверно ниже контрольных значений – 58,9±2,15% (P<0,001). Не достоверный дефицит CD3+ маркеров Т-лимфоцитов у детей больных с РРПГ в сравнении с данными контроля обнаружен и при анализе их абсолютных значений – 1082,8±55,52 клеток/мкл. против 1149,1±107,32 клеток/мкл. (P>0,05) (табл.1).
Анализ результатов при ЧРПГ показал следующие неоднозначные изменения показателей клеточного и гуморального иммунитета.
Таблица 1. Показатели клеточного звена иммунитета
Относительное количество лейкоцитов у детей с ЧРПГ (6,6±0,38 тыс. клеток/мкл против 5,3±0,30 тыс.клеток/мкл в контроле, Р<0,02) было достоверно повышено.
При РРПГ наблюдалась тенденция к повышению (37,4±0,71% и 2151,3±128,26 клеток/мкл) относительного и абсолютного общего пула лимфоцитов (при контроле 35,9±1,32% и 1930,3±159,90 клеток/мкл). Отмечалась достоверное снижение у больных при ЧРПГ относительного количества CD3+-лимфоцитов (42,8±1,05%, P<0,001, против контрольных значений 58,9±2,15%). При изучении субпопуляционного состава лимфоидных клеток у обследованных нами детей были выявлены своеобразные изменения функциональной активности и перераспределение субпопуляций лимфоцитов.
Анализ результатов изучения относительного и абсолютного содержания Т-хелперов/индукторов при РРПГ показал достоверное снижение числа CD4+-клеток в среднем до 25,4±0,55%, что в 1,32 раза ниже контрольных значений (P<0,001). Абсолютное число CD4+-клеток имело тенденцию к снижению, но не отличалось достоверно от контрольных значений. Известно, что именно CD4+ -лимфоциты играют ключевую роль в защите от вирусных инфекций.
Известно, что CD8+-лимфоциты способны узнавать чужеродный антиген только вместе с собственными молекулами этого класса. Нами было установлено, что в крови у здоровых детей относительное число Т-супрессоров/цитотоксических лимфоцитов составил - 23,7±0,93% и абсолютное количество – 463,9±44,37 клеток/мкл. У детей при РРПГ в дооперационном периоде содержание CD8+- клеток, как относительное, так и абсолютное не отличались от показателей контрольной группы, составляло соответственно 25,1±0,59% и 541,8±32,05 клеток/мкл.
При ЧПРГ выявилась достоверное снижение относительного (21,4±0,80%, P<0,001) количества и незначительная тенденция к снижению абсолютного числа (608,7±74,92 клеток/мкл, P>0,05) CD4+ клеток у нелеченных больных при соответствующих контрольных (33,6±1,75% и 663,3±71,44 клеток/мкл) показателей. Выявлено достоверное повышение абсолютного числа Т-супрессорных цитотоксических (CD8+) клеток при ЧРПГ (655,4±78,69 клеток/мкл, P<0,05). А относительные количества этих клеток оставались в пределах контрольных значений.
Следовательно, при РРПГ и ЧРПГ наблюдается снижение относительного содержания Т-хелперов, и содержание Т-супрессоров не изменяется, чем и объясняется снижения (P<0,001) иммунорегуляторного индекса.
Естественные киллеры (ЕК) – лимфоциты, лишенные маркеров Т- и В-лимфоцитов и свойственных им антигенраспознающих рецепторов. При первичном контакте ЕК осуществляют быстрый цитолиз инфицированных вирусами клеток хозяина, являясь важными факторами противовирусной защиты, особенно на ранних этапах иммунопатологии. Количественное изучение относительного содержания ЕК показало, что у детей при РРПГ и ЧРПГ в дооперационном периоде в периферической крови содержание CD16+-лимфоцитов составляло соответственно – 10,6±0,36% (P<0,01) и 8,6±0,54%, (P<0,001), что достоверно отличается от контрольных значений – 12,9±0,65%. Изучение абсолютного содержания CD16+-лимфоцитов при РРПГ выявило тенденцию к их снижению до 227,3±14,16 клеток/мкл. по сравнению с контрольными данными (250,3±23,22 клеток/мкл.), тогда при ЧРПГ их абсолютное содержание было в пределах контроля (P>0,05). В ходе иммунного ответа В-лимфоциты (CD19+) дифференцируются в плазматические клетки, секретирующие антитела. В-лимфоциты могут развивать адекватный иммунный ответ только с помощью Т-хелперов.
Наши исследования показали, что в периферической крови у детей при РРПГ в дооперационном периоде относительное содержание В-лимфоцитов повышалось и недостоверно отличалось от показателей контрольной группы и составляло в среднем 27,1±0,73% (табл.2).
Таблица 2. Показатели гуморального звена иммунитета
Абсолютное значение данного показателя имело тенденцию к повышению, но не отличалось от контрольных показателей и определялось в пределах 582,8±34,63 клеток/мкл. при контроле 481,0±49,27 клеток/мкл.
При ЧРПГ относительные и абсолютные количества CD19+ клеток достоверно увеличились (31,1±1,32% и 893,9±113,93 клеток/мкл против 24,6±1,21% и 481,0±49,27 клеток/мкл в контроле).
Интегральным показателем функциональной активности В-лимфоцитов является содержание иммуноглобулинов основных классов (G, A, M). Изучение концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови у здоровых детей дошкольного возраста показало, что уровень IgG составила 1168,8±38,87 мг/%, а у детей при РРПГ и ЧРПГ в дооперационном периоде наблюдалась достоверное снижение содержания IgG соответственно – 1011,3±23,01 мг/% (P<0,001) и 906,6±33,73 мг% (P<0,001).
У детей контрольной группы уровни IgA и IgM в сыворотке крови содержатся в пределах – 131,0±4,52 мг/% и 132,9±7,06 мг/%, а у детей при РРПГ до операции их содержание составило соответственно – 124,7±4,37 мг/% и 131,0±5,13 мг/%, что не отличались от показателей контроля. При ЧРПГ концентрация иммуноглобулина IgA снижалась достоверно и составило 114,7±2,83 мг% (P<0,01).
Любая иммунологическая реакция в независимости от преобладания гуморального или клеточного ответа начинается с пролиферации. Одним из критериев оценки пролиферативного процесса может быть увеличение или снижение количества лимфоцитов с рецептором к IL-2 (CD25+).
Изучение количества лимфоцитов с маркерами ранней активации CD25+ показало, что у детей при РРПГ в дооперационном периоде число этих клеток имело тенденцию к снижению по сравнению с показателем контрольной группы, но не отличались статистически. Так, количество CD25+-лимфоцитов в контрольной группе составило в среднем 28,1±1,37% а в основной группе – 25,7±0,73% (P>0,05). У больных при ЧРПГ относительные показатели CD25+ достоверно снизились до 23,7±0,85% (P<0,01).Абсолютные значения этих клеток тоже не отличались по сравнению с контрольными значениями (табл.3).
Таблица 3. Показатели некоторых активационных маркеров иммунитета
В настоящее время кроме пассивной гибели клеток выделяется их активное саморазрушение – контролируемый организмом процесс, направ-ленный на поддержание гомеостаза – апоптоз. Принято считать, что основное предназначение апоптоза как физиологического процесса – поддержание постоянного количества клеточных элементов в органах, тканях организма и удаление клеток, прошедших свой жизненный цикл. В отличие от гибели клеток, вызываемой патологической ситуацией, процессы апоптоза происходят в ядре и цитоплазме при сохранении целостности клеточной оболочки. По мнению некоторых авторов, апоптоз играет двойную роль: положительную – самоубийство клеток приводит к гибели антигена, и отрицательную – самоубийство клеток снижает содержание иммунокомпетентных клеток. В наших исследованиях при РРПГ наблюдалась тенденция к повышению относительного содержания лимфоцитов с рецептором к апоптозу (CD95+) в среднем до 28,2±0,56 % при контроле 25,1±1,73%, а в абсолютное число этих клеток имело достоверный характер повышения – до 606,8±32,98 клеток/мкл. (P<0,05), при контроле 484,6±46,69 клеток/мкл.
У больных при ЧРПГ относительные и абсолютные показатели CD95+ лимфоцитов достоверно повышались и составили соответственно 31,2±0,85% (P<0,01) и 863,5±99,87 клеток/мкл (P<0,001).
Нами было проведено исследование уровней некоторых цитокинов. Цитокины это гуморальные белковые продукты, которые вырабатываются клетками тканей организма и клетками иммунной системы.
ИЛ-1β – это важный медиатор, который является одним из наиболее универсальных регуляторов иммунитета и воспалительных реакций с широким спектром биологических эффектов, включающих пролиферацию Т- и В-лимфоцитов, антителообразование, индукцию синтеза других цитокинов и т.п. У детей при РРПГ и ЧРПГ в дооперационном периоде уровень продукции ИЛ-1β был достоверно повышен (в 26,3 и 31,1 раза соответственно) по сравнению со здоровыми детьми (380,7±11,42 пг/мл и 450,8±16,12 пг/мл против 14,5±0,75 пг/мл, P<0,001) (табл.4).
Таблица 4. Концентрации некоторых цитокинов иммунитета
Активация специфического иммунного ответа опосредуется рядом цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4 и др.), регулирующих рост и дифференцировку лимфоцитов и способствующих этой фазе иммунного ответа. Из них ИЛ-4 обладает широким спектром биологического действия, наиболее известным является угнетение воспалительного ответа и увеличение гуморального иммунитета, угнетение моноцитарно-макрофагальной системы блокированием активирующих влияний γ-ИНФ, он также способствует ограничению активности ЕК, макрофагов и активации Т-супрессоров.
У практически здоровых детей уровень ИЛ-4 составляет в среднем 18,1±0,96 пг/мл, а в дооперационном периоде у детей при РРПГ и ЧРПГ наблюдается повышение его уровня до 201,0±4,96 пг/мл и 232,6±6,34 пг/мл, соответственно, что достоверно выше, чем в контроле (P<0,001).
Важную роль в координации функциональной сопряженности многокомпонентной иммунной системы играют интерфероны, представляющие собой группу биологически активных белков или гликопротеидов, синтезируемых клеткой в процессе защитной реакции на чужеродные антигены. Из них γ-ИНФ генерируется вследствие стимуляции Т-лимфоцитов и ЕК и продуцируется только иммунокомпетентными клетками. Он также играет важную роль в развитии иммунного ответа по Тh-1-типу, способствуя экспрессии β2-субъединицы рецепторов для ИЛ-12. Кроме того, γ-ИНФ блокирует развитие Тh-2-типа, угнетая синтез ИЛ-4.
Анализ результатов исследования по изучению уровня γ-ИНФ в сыворотке периферической крови у здоровых детей показал, что концентрация его составляет 25,2±1,84 пг/мл, в то время как в дооперационном периоде у детей с РРПГ и ЧРПГ уровни γ-ИНФ составили в среднем 23,0±0,73 пг/мл и 18,0±0,70 пг/мл, что в 1,1 и 1,4 раза ниже (P>0,05) контроля.
Таким образом, у детей при РРПГ в дооперационный период обнаружены значительные изменения в иммунной системе по сравнению с аналогичными показателями здоровых детей. Выявлено достоверное снижение общего количества CD3, CD4 и CD16 лимфоцитов и уровня IgG. Отмечается тенденция к снижению количества CD25 клеток и тенденция к повышению числа CD8, CD19 и CD95 клеток. Уровни цитокинов ИЛ-1β и ИЛ-4 повышаются соответственно в 26,3 и 11,1 раза, а концентрация γ-ИНФ снижается в 1,1 раза. При ЧРПГ выявлено достоверное повышение количества CD19 и CD95 клеток, снижение количества CD3, CD4, CD16, CD25 лимфоцитов и уровня иммуноглобулинов А и G. Продукции ИЛ-1β и ИЛ-4 повышаются соответственно в 31,1 и 12,9 раза, а концентрация γ-ИНФ снижается и становятся достоверно ниже контрольных значений.
Выводы
- Состояние иммунной системы больных при РРПГ и ЧРПГ характеризуется недостаточностью неспецифической иммунной защиты и Т-клеточного звена иммунитета, которая проявляется снижением экспресссии маркерных рецепторов CD16+, CD3+ и CD4+ лимфоцитов; снижением иммунорегуляторного индекса; активацией CD95+; а также на фоне повышения содержания В-лимфоцитов снижаются концентрации иммуноглобулинов IgA и IgG
- Цитокиновый профиль больных с РРПГ и ЧРПГ характеризуется дисбалансом концентрации цитокинов, повышенной продукцией так провоспалительного (ИЛ-1β), так и противовоспалительного цитокина (ИЛ-4) и снижения уровня ИФН-γ.