Согласно современным представлениям, многие физиологические и метаболические процессы, протекающие в организме, как ребенка, так и взрослого, связаны со свободнорадикальным окислением (СРО) липидов, белков, углеводов. Оно непрерывно протекает в норме во всех тканях живых организмов и при определенной интенсивности является одним из типов нормальных метаболических процессов [1-4]. Умеренная активация окислительных реакций лежит в основе обновления липидов биологических мембран и модификации их функций. Эта особенность используется клетками в процессе адаптации и отражает защитно-приспособительные реакции организма на молекулярном уровне [2, 5-8]. Безопасный уровень СРО обеспечивается антиоксидантной системой (АОС), представленной ферментативными (супероксиддисмутаза, каталаза, ферменты системы глутатиона и др.) и неферментативными компонентами (витамины А, Е, С, Р, Д, каротины и др.) [1, 2].
Перспективным способом изучения процессов СРО и АОС является регистрация хемилюминесценции (ХЛ) – сверхслабого свечения, возникающего при взаимодействии радикалов [1, 3]. С помощью ХЛ удается выявить наиболее реакционноспособные короткоживущие радикалы, которые другими способами не регистрируются [3].
К настоящему времени в России используются разные, преимущественно отечественные, приборы для регистрации биорадикальных процессов. Нет единой методической базы, что не позволяет получать сопоставимые и корректные результаты для исследователей [9]. В литературе имеются данные о состоянии у здоровых детей СРО и АОС сыворотки крови у 10 детей 11-17 лет [10], сыворотки крови и мочи у 12 детей 6-10 лет, у 30 детей 11-17 лет [11]. В связи с применением разных приборов, представленные результаты отличаются. Не проводился анализ зависимости биорадикальных процессов в зависимости от пола.
Цель исследования: изучить состояние свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы крови методом хемилюминесценции у здоровых детей Смоленской области в зависимости от возраста и пола с помощью хемилюминометра BRR-02 (Россия).
Материалы и методы. На базе областной детской клинической больницы (г. Смоленск) и проблемной научно-исследовательской лаборатории клинической биофизики и антиоксидантной терапии СГМА проведено общеклиническое исследование 40 практически здоровых детей (1, 2 группы здоровья) с 1 года до 16 лет с функциональными нарушениями. Не включались дети с аллергическими заболеваниями, лабильной артериальной гипертензией, анемией, острой респираторной вирусной инфекцией, а также часто болеющие. 20 детей было с синдромом вегетативной дисфункции, 6 - с миопией глаз (легкая и средняя степени тяжести), 3 – с астигматизмом глаз, 2 – с функциональной диспепсией, 9 – с дисфункцией желчевыводящих путей. Мальчиков было 19 (48%), девочек - 21 (52%). В соответствии с возрастной классификацией возрастной периодизации института возрастной физиологии РАМН по рекомендациям ВОЗ все обследуемые дети были разделены на 3 возрастные группы. 1-ю группу (1-7 лет) составили 12 детей (30%), 2-ю группу (8 – 12 лет) – 12 детей (30%), 3-ю группу (13 лет – 16 лет) – 16 человек (40%). Дети и их родители до исследования ознакомились и подписали добровольное согласие информированного больного, утвержденное этическим комитетом.
У обследуемого ребенка утром натощак в асептических условиях проводили забор 0,08 мл крови из пальца в эппендорф с 0,02 мл 5% раствора цитрата натрия. В полученной цельной крови определяли активные формы кислорода (АФК) методом люминолзависимой ХЛ, стимулированной кристаллами сульфата бария [12]. В ходе исследования записывали кривую (рис. 1), в последующем рассчитывали ХЛ-АФК (х 105 квант/с х 4π).
Рис. 1. Амплитуда вспышки люминолзависимой хемилюминесценции лейкоцитов, стимулированной кристаллами сульфата бария: Акр – амплитуда контрольного сигнала прибора, Аобр – амплитуда образца
Из кубитальной вены забирали 1 мл крови. Венозную кровь центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/мин. Для определения уровня перекисей липидов (ПЛ) и антиокислительной активности (АОА) сыворотки крови использовали активированную родамином Ж (синтетический краситель) ХЛ в присутствии Fe2+ [13]. При введении в стандартный раствор 0,1 мл исследуемой сыворотки регистрировали амплитуду быстрой (Аб пр) и медленной (Ам пр) вспышек ХЛ-сигнала относительно контрольных проб (Аб пр и Ам пр), которые были пропорциональны уровням ПЛ (формула 1) и АОА (формула 2) (рис. 2).
ПЛ, отн. ед. = (Аб пр, мм / Аб ст, мм) х 100 (1)
АОА, отн. ед. = ((Ам пр – Ам ст/) / Ам ст) х 100 (2)
Состояние СРО оценивали по уровню генерации АФК лейкоцитами цельной крови и ПЛ сыворотки крови, а АОС - по уровню АОА сыворотки крови.
Статистический анализ выполнялся с помощью программы Microsoft Excel 2003. Для проверки гипотезы о нормальном распределении признаков использовался критерий согласия Χ2 на уровне значимости (α) 0,05. Для количественной оценки типичного уровня и вариации изучаемых признаков использовались медиана (Ме), межквартильный размах (25-й (Lq) и 75-й (Uq) перцентили). Для выявления различий между двумя нормальными выборками использован Student t-test. При сравнении количественных признаков трёх независимых выборок применялся ранговый анализ вариаций Kruskel-Wallis ANOVA. Далее для определения между какими именно группами имеются различия - критерий Dana [14].
Рис. 2. Хемилюминесценция сыворотки крови: Аб пр – амплитуда быстрой вспышки пробы; Аб ст - амплитуда быстрой вспышки стандарта; Ам пр - амплитуда медленной вспышки пробы; Ам ст – амплитуда медленной вспышки стандарта; ЖЛП – желточный липопротеид
Результаты и их обсуждение. Анализируя показатели СРО и АОС в зависимости от возраста, статистически значимых различий выявлено не было. Более низкие значения АФК, ПЛ и АОА были у детей 1 возрастной группы, чем в других, однако статистически значимых различий не получено (p>0,05) (табл. 1). Возможно, это обусловлено тем, что для этого возрастного периода характерны более низкие темпы роста и развития, рацион питания становится более разнообразным, включающий большее количество естественных антиоксидантов.
Таблица 1. Показатели СРО и АОС здоровых детей в зависимости от возраста (Ме (Lq; Uq))
Примечание: здесь и далее р – различия показателей между группами
При анализе показателей в зависимости от пола различий не выявлено (табл. 2). При анализе показателей СРО и АОС в зависимости от пола и возраста как в каждой возрастной группе, так и между группами, также статистически значимых различий не было выявлено (табл. 3).
Таблица 2. Показатели СРО и АОС здоровых детей в зависимости от пола (Ме (Lq; Uq))
Не выявлено статистически значимых особенностей показателей свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы крови методом хемилюминесценции у здоровых детей Смоленской области в зависимости от возраста и пола с использованием хемилюминометра BRR-02 (Россия).
Таблица 3. Показатели СРО и АОС здоровых детей в зависимости от пола и возраста (Ме (Lq; Uq))
