Введение. В настоящее время приоритетным направлением в молекулярной медицине является поиск генетических маркеров предрасположенности к хроническому, тяжелому и осложненному течению социально значимых вирусных и бактериальных инфекций. С этой позиции, инфекционные заболевания представляют удобную модель для изучения роли молекулярных особенностей макроорганизма в развитии патологического процесса, так как позволяют разграничить влияние этиологического агента инфекционного заболевания и молекулярно-генетических особенностей инфицированного [1,7]. Но, несмотря на очевидный интерес специалистов к этой проблеме, остаются нерешенными вопросы, касающиеся предрасположенности и резистентности организма человека к вирусным инфекциям, а также приводящие к разным исходам встречи макроорганизма с инфекционным агентом (выздоровление, формирование грозных осложнений, летальный исход).
Одной из инфекций, имеющей огромное социально-экономическое значение, является грипп [6]. Генетическая способность вирусов гриппа к антигенной изменчивости обуславливают высокую восприимчивость населения и основные эпидемиологические особенности этой инфекции в виде повсеместного распространения, вовлечения в эпидемический процесс всех возрастных групп с формированием крупных эпидемий и пандемий [8]. В марте 2009 г. практически одновременно в Мексике и Калифорнии на спаде сезонной заболеваемости гриппом зарегистрирована заболеваемость и смертность от гриппа, отличающегося тяжелой клинической картиной с серьезными осложнениями, включающими бронхиолит, пневмонию и отек легких [2]. Вирусные изоляты, полученные от первых пациентов, принадлежали к подтипу вируса гриппа А H1N1, в дальнейшем установлено его тройное происхождение с сочетанием генов гриппа свиней, птиц и человека. Новый вирус гриппа стал стремительно распространяться по миру и уже в октябре 2009 г. вирус AH1N1v (вирус пандемического гриппа) – абсолютная копия Калифорнийского вируса, полностью господствовал на территории России [2]. Одним из первых регионов Российской Федерации, встретившихся с пандемическим вирусом гриппа, стал Забайкальский край, где наблюдалась не только высокая заболеваемость пандемическим гриппом, но и высокая летальность.
Известно, что предназначение врожденного иммунитета состоит в препятствии инвазии микробов в организм. Эту функцию выполняют лейкоциты, дендритные клетки и макрофаги, располагающиеся на границе тканей и окружающей среды и распознающие микроорганизмы с помощью специфических Toll-рецепторов. Воспаление при этом, не является специфичной реакцией на патоген, но зависит от молекулярных структур патогена. При развитии воспалительной реакции в первую очередь синтезируются провоспалительные цитокины, инициирующих дифференцировку Т-лимфоцитов и определяя вариант развития приобретенного иммунитета по клеточному и гуморальному типу, направленный на элиминацию микроорганизма. Однако тяжелые и генерализованные формы инфекционного процесса сопровождаются гиперпродукцией провоспалительных цитокинов с формированием системной воспалительной реакции. Немаловажную роль в ликвидации этого процесса отводят противоспалительным цитокинам – интерлейкинам (IL) 4, 10 [4]. Установлено, что при гриппозной инфекции недостаточное их образование обуславливает «цитокиновый шторм», являющейся пусковым механизмом развития системной воспалительной реакции (ССВР) с риском формирования синдрома полиорганной недостаточности [3]. Одним из ключевых противовоспалительных цитокинов является IL10. С одной стороны IL10 способен нивелировать гиперпродукцию провоспалительных цитокинов, но помимо супрессии продукции провоспалительных цитокинов, IL10 способен подавлять антигенпредставляющую функцию макрофагов и дендритных клеток, в связи, с чем IL10 представляет собой и существенный ингибитор клеточного иммунитета [10]. Так, IL10 может вызывать изменение направленности иммунного ответа, выводя его из Th1 в Th2- зависимый иммунный ответ.
В связи с вышеуказанным, при гриппозной инфекции представляется актуальным изучение не только содержания противовоспалительных цитокинов, но и поиск их генетических полиморфизмов. Выявление генетических дефектов в генах противовоспалительных цитокинов может сопровождаться различной их продукцией и обуславливать индивидуальные особенности течения инфекционного процесса у носителей полиморфных мутаций.
Цель исследования – изучить частоту встречаемости генотипов полиморфного маркера гена IL10 (G-1082A, C-592A, C-819T) у детей при неосложненном течении гриппа.
Материалы и методы. В исследование включен 141 ребенок с неосложнённым течением гриппа. Основную группу исследуемых составили 114 детей с гриппом А H1N1/v, проходивших стационарное лечение в ГУЗ «Краевая клиническая инфекционная больница» (Забайкальский край) в эпидемический сезон октябрь-декабрь 2009 г. Группу сравнения составили 27 детей с сезонным гриппом A H3N2 в постэпидемический период.
В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki (1964, 2000 - поправки) и Правилами клинической практики в Российской Федерации", утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266 [5].
Диагноз гриппа А H1N1/v устанавливался на основании эпидемиологического анамнеза, комплекса характерных клинических симптомов и верифицировался путем обнаружения РНК вируса в назофарингеальных мазках методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и/или с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в парных сыворотках с нарастанием титра антител. Сезонный грипп устанавливался на основании идентификации РНК вируса гриппа A H3N2 в назофарингеальных мазках. Распределение исследуемых по группам, полу и возрасту представлены в табл.1.
Таблица 1. Распределение больных по группам, полу и возрасту
Для определения тяжести течения гриппа А H1N1/v пользовались общепринятой классификацией гриппа [9].
В качестве контрольной группы для оценки распределения генотипов исследуемых полиморфизмов в популяции обследовано 200 здоровых детей, сопоставимых по полу и возрасту с основной группой.
Материалом для молекулярно-генетического анализа служили образцы ДНК, выделенные из периферической венозной крови. Для исследования выбраны три точки мутации IL10 в позиции 1082 (G>A), 592 (C>A) и 819 (C>T). Амплификацию проводили в термоцикле (модель Ре «Бис» - М111 (ООО «Бис-Н», Новосибирск). В работе использовались стандартные наборы праймеров научно-производственной фирмы «Литех»-«SNP» (Москва). Визуализация продуктов амплификации выполнена с помощью электрофореза в 3% агарозном геле с добавлением бромистого этидия, проходящем в ультрафиолетовом свете.
Полученные данные подвергали статистической обработке с помощью программы «BIOSTAT». При сравнении частот и групп по качественному бинарному признаку пользовались критерием χ2. Различия считались статистически значимыми при p<0,05. Для определения частот аллельных вариантов генов применялся закон Харди-Вайнберга. С целью оценки ассоциаций аллелей с генотипом рассчитывали относительный риск (ОР) и отношение шансов (ОШ).
Результаты исследования и их обсуждение. Распределение распространенности генотипов полиморфного локуса G-1082A, C-592A, C-819T гена IL-10 в группе больных и контрольной группе соответствовало ожидаемому равновесию Харди-Вайнберга.
Распределение распространенности генотипов G-1082A, C-592A, C-819T гена IL-10 у здоровых лиц и у больных гриппом представлены в табл. 2.
Таблица 2. Распределение генотипов IL-10 (G-1082A), (C-592A), (C-819Т) среди больных с гриппом и здоровых индивидуумов
Примечание: здесь и далее * - статистическая значимость различий с контролем; ** - статистическая значимость различий с группой клинического сравнения
Установлено, что генотип G/G полиморфного маркера гена IL10 G-1082A выявлялся реже у пациентов с сезонным гриппом (p=0,003) и при нетяжелом течении гриппа A H1N1/v (p=0,0001) по сравнению со здоровыми детьми. Однако, при тяжелом течении пандемического гриппа данный генотип обнаруживался чаще, чем у здоровых (p=0,003). Помимо этого наблюдались статистические значимые различия в частоте регистрации генотипа G/G гена G-1082A у пациентов с тяжелым течением гриппа A H1N1/v относительно больных с сезонным гриппом (p=0,022) и детей с нетяжелым течением пандемического гриппа (p=0,0001). Генотип G/А IL10 G-1082A, напротив, выявлялся чаще во всех группах обследуемых с гриппом в отличие от здоровых индивидуумов (p=0,001). У детей со среднетяжелым и тяжелым течением гриппа A H1N1/v генотип G/А регистрировался чаще относительно группы сравнения (p=0,024) и больных с легким течением пандемического гриппа (p=0,022). Генотип А/А этого же полиморфизма встречался исключительно при среднетяжелой и тяжелой формах гриппа A H1N1/v (p=0,0001), причем в 1,1 раза чаще при последней.
При сезонном гриппе и нетяжелом течении пандемического гриппа генотип С/С полиморфного гена IL10 С-592А выявлялся реже по сравнению с контрольной группой (p=0,0001). Тогда как у детей с тяжелым течением гриппа A H1N1/v частота его регистрации не отличалась от здоровых индивидуумов (p=0,685). Однако, у детей при тяжелом течении пандемического гриппа данный генотип наблюдался в 1,8 раза чаще по сравнению с сезонным гриппом и в 2,9 раза чаще среднетяжелых форм гриппа A H1N1/v. Оценивая частоту распространенности генотипа С/С с группой сравнения и группами пациентов с легким и среднетяжелым пандемическим гриппом статистически значимых отличий на найдено (p=0,212, p=0,094, соответственно). Обнаружение генотипа С/А при сезонном гриппе, а также при легком и тяжелом течении пандемического гриппа отличалось от группы контроля (p=0,0001). А при тяжелом гриппе этот генотип выявлялся достоверно реже в сравнении с сезонным гриппом и нетяжелыми формами гриппа A H1N1/v. Среднетяжелое течение пандемического гриппа характеризовалось частой регистрацией генотипа А/А полиморфного гена IL10 С-592А по сравнению со здоровыми детьми (p=0,0001) и не обнаруживался в других исследуемых группах больных гриппом.
Анализируя распространенность генотипа С/С полиморфизма гена IL10 C-819Т установлено его более редкое обнаружение у пациентов с сезонным гриппом и при нетяжелом течении пандемического гриппа у детей в сравнении со здоровыми (p=0,0001). А тяжелые формы гриппа A H1N1/v сопровождались более частой регистрацией данного генотипа не только по сравнению с контролем, но и пациентами других клинических групп (p=0,0001). Противоположная ситуация наблюдалась в отношении генотипа С/Т. Так, распространенность его была выше у детей с сезонным гриппом и при нетяжелых формах пандемического гриппа, а при тяжелом течении гриппа A H1N1/v генотип С/Т выявлялся реже (p=0,0001).
Частота аллельных вариантов гена IL-10 (G-1082A), (C-592A), (C-819Т) у детей с гриппом представлена в табл. 3.
Установлено, что сезонный грипп и нетяжелые формы пандемического гриппа у детей сопровождались более редким, чем у здоровых детей, обнаружением аллели G гена IL10 G-1082А, аллели С гена IL10 С-592А и аллели С гена IL10 C-819T. Тогда как, аллель А гена IL10 G-1082А, аллель А гена IL10 С-592А и аллель Т гена IL10 C-819T в этих группах наблюдалась чаще. Распространенность аллелей в генах IL10 G-1082А, IL10 С-592А и IL10 C-819Т в группе больных с тяжелым течением пандемического гриппа не отличалась от группы контроля. В тоже время, тяжелые формы гриппа у детей характеризовались более редкой регистрацией аномальных аллелей А гена IL10 G-1082А, А гена IL10 С-592А, Т гена IL10 C-819Т относительно пациентов как с сезонным гриппом, так и нетяжелыми формами гриппа A H1N1/v.
Таблица 3. Частота аллельных вариантов в гене IL-10 (G-1082A), (C-592A), (C-819Т) среди больных с гриппом и здоровых индивидуумов, (Р)
Расчет относительного риска выявил, что генотипы А/А и G/А IL10 G-1082A при гриппе у детей, независимо от серологического подтипа вируса гриппа А, свидетельствует о положительной ассоциации данных генотипов с гриппозной инфекцией. Так, относительный риск генотипов А/А и G/А IL10 G-1082A при сезонном гриппе составил 2,14 [0,71;3,42], при легком течении пандемического гриппа – 2,79 [1,74; 3,83], а у пациентов со среднетяжелой и тяжелой формой гриппа A H1N1/v соответственно, 3,36 [2,4; 4,19] и 1,42 [-0,99; 2,89]. Аналогичные данные получены при расчете относительного риска гриппозной инфекции с генотипами С/Т и Т/Т гена IL10 C-819T. Иная закономерность выявлена при расчете относительного риска заболевания с генотипами С/А и А/А гена IL10 С-592А. Положительная ассоциация этих генотипов определена с сезонным гриппом (ОР=2,59 [1,13;4,05], а так же с легкой (ОР=3,5 [2,27; 4,54] и среднетяжелой (ОР=3,84 [2,63; 4,68] формами пандемического гриппа. А при тяжелой форме гриппа A H1N1/v показатель относительного риска равный 0,56 [-5,34; 2,15] указывает на отрицательную ассоциацию с генотипами С/А и А/А гена IL10 С-592Т и может расцениваться как фактор устойчивости.
Таким образом, нами обнаружено, что распространённость генотипов G/G IL10 G-1082A, С/С IL10 С-592А и С/С IL10 С-819Т при тяжелых формах пандемического гриппа не отличается от группы здоровых детей, но чаще регистрируется, чем у детей с сезонным гриппом и нетяжелым течением гриппа A H1N1/v. Генотип A/A гена IL10 G-1082A и генотип Т/Т гена IL10 C-819Т встречаются преимущественно у детей с тяжелым течением пандемического гриппа, а генотипы С/А и А/А гена IL10 С-592А могут расцениваться при нем как протективный фактор. Полученные данные, свидетельствующие о разной частоте распространенности генотипов IL10 у детей с гриппом, могут указывать на разнонаправленное содержание уровня IL10 в сыворотке крови у пациентов с различным течением гриппозной инфекции у детей. Более частое обнаружение генотипов G/G гена IL10 G-1082A, C/С гена IL10 C-592А и С/С гена IL10 C819T при тяжелых формах пандемического гриппа по сравнению с его нетяжелым течением, вероятно, протекают с гиперпродукцией IL10, направленную на нивелирование проявлений воспалительной реакции системного характера со свойственной ей высокой продукцией провоспалительных цитокинов. Нетяжелые формы гриппозной инфекции не сопровождаются ССВР, в связи с чем более частая регистрация генотипов G/А гена IL10 G-1082A, C/А гена IL10 C-592А и С/Т гена IL10 C819T при этих формах, могут характеризоваться более низким содержанием IL10. А установленные генотипы С/А и С/С гена IL10 C-592А, как факторы устойчивости при тяжелом течении гриппа A H1N1/v, вероятно способствуют соразмерной продукции IL10, направленной на ликвидацию «цитокинового шторма». Эти предположения подтверждает то факт, что среди исследуемых нами больных с тяжелым течением пандемического гриппа, летальные случаи не регистрировались. Полученное отсутствие разницы распространённости генотипов С/А, С/С гена IL10 С-592А у здоровых детей и пациентов с тяжелом течением пандемического гриппа, объясняется тем, что наличие мутации само по себе не достаточно для развития этого заболевания. У генетически предрасположенных индивидуумов гриппозная инфекция будет развиваться по обычной схеме взаимодействия в системе «вирус гриппа-макроогранизм», но наличие выявленных мутаций могут оказывать влияние на исход заболевания.
Выводы
1. Распространённость генотипов G/А гена IL10 G-1082A, C/А гена IL10 C-592А и С/Т гена IL10 C819T у детей с сезонным гриппом и нетяжелых формах пандемического гриппа выше, по сравнению со здоровыми, а генотипов G/G гена IL10 G-1082A, C/C гена IL10 C-592А и С/C гена IL10 C819T - ниже.
2. Выявление генотипов С/С и С/А гена IL10 C-592А при тяжелых формы гриппа A H1N1/v не отличалась от здоровых детей.
3. Сезонный грипп характеризуется отсутствием генотипов A/A гена IL10 G-1082A, А/А гена IL10 C-592А и Т/Т гена IL10 C819T.
4. Тяжелое течение пандемического гриппа сопровождается более частым, по сравнению с сезонным гриппом и нетяжелыми формами гриппа A H1N1/v, обнаружением генотипов А/А гена IL10 G-1082A и Т/Т гена IL10 C819T.
5. Аллель А полиморфного маркера гена IL10 C-592А у детей с тяжелым течением гриппа A H1N1/v может быть расценен как фактор защиты.