Русский English

Совалкин В.И., Поморгайло Е.Г., Сабитова О.Н., Подгурская Е.П.

Роль полиморфизма генов фактора некроза опухоли-альфа G-308А, интерлейкина-1бета С-511Т и интерлейкина-10 G-1082А в развитии затяжного течения внебольничной пневмонии

Омская государственная медицинская академия

Несмотря на достижения в изучении патогенеза и терапии пневмоний, до настоящего времени не удалось достигнуть существенных изменений в уровнях заболеваемости и смертности [1]. Заболеваемость внебольничной пневмонией (ВП) достигает 14-15%, а общее число больных ежегодно превышает 1,5 млн. человек [1]. Возрастает количество пациентов с вялотекущим течением заболевания (до 40%). Медленно разрешающаяся (затяжная) пневмония приводит к значительным финансовым затратам за счет привлечения дополнительного обследования, модификации терапии [1, 2]. В связи с чем, своевременная оценка факторов риска медленно разрешающегося течения пневмонии приобретает в этой ситуации первостепенное значение.

Благодаря результатам выполнения международной и национальных программ «Геном человека» (2000 г.) появилась возможность изучения наследственной компоненты подверженности различным заболеваниям [3].

Имеются данные, свидетельствующие о генетической предрасположенности к различной реализации воспалительного ответа. Изучение генетических детерминант внебольничной пневмонии позволяет не только проникнуть в фундаментальные механизмы иммунитета и патологии при ВП, но и использовать методы генетического типирования с целью совершенствования диагностики и терапии различных форм заболевания [3, 4].

Особый интерес представляет изучение генов цитокинов, кодирующих продукцию одноименных белковых продуктов. Гены интерлейкинов обладают чрезвычайно высокой степенью полиморфизма, причем количество участков этого полиморфизма в одном гене может достигать нескольких десятков и располагаться они могут как в кодирующих экзонах, так и в интронах и, что особенно важно, в промоторных регуляторных зонах структуры гена [3-5]. Эти участки ДНК содержат зоны связывания регуляторных факторов, которые определяют не структуру, а количество белкового продукта [5].

В развитие этой концепции нами проведен анализ полиморфизма генов цитокинов фактора некроза опухоли-α (ФНОα), интерлейкинов-1β и -10 (ИЛ-1β и ИЛ-10), расположенных именно в промоторных участках генов и изучена их связь с развитием осложнений, длительностью разрешения инфильтрации легочной ткани и другими клиническими и рентгенологическими детерминантами ВП.

Цель исследования: изучить распределение генотипов и аллелей генов ФНОα G-308A, ИЛ-1β C-511T, ИЛ-10 G-1082A у пациентов с затяжным течением пневмонии и их связь с клиническими особенностями ВП.

Материалы и методы. Проведено открытое когортное проспективное исследование [6]. В работу вошли все пациенты (n=89) с диагнозом «внебольничной пневмонии» [1], соответствующие критериям включения и исключения (52 мужчин и 37 женщин, средний возраст 48,5 (33,5; 59) лет), находившиеся на лечении в пульмонологическом отделении БУЗОО Областной клинической больнице в 2008-2009 г. Все пациенты дали письменное добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Работа одобрена этическим комитетом. Из исследования были исключены пациенты с подтвержденной ВИЧ-инфекцией, больные, получавшие терапию иммунодепрессантами, беременные женщины. Динамическое наблюдение за пациентами осуществлялось в 4 этапа. Состояние пациентов оценивали в начале заболевания (1 этап, 1-2 сутки госпитализации), через 72 часа (2 этап) и при появлении признаков клинического выздоровления (3 этап, 10-14 сутки госпитализации). Контрольное исследование (4 этап) проводили через 21-42 дня после начала заболевания. На последнем этапе пациенты были разделены на 2 группы в зависимости от исхода заболевания. Медленный регресс рентгенологических изменений с уменьшением размеров пневмонической инфильтрации менее чем на 50% к исходу 2–й недели и неполным разрешением к исходу 4–й недели от начала заболевания при улучшении клинической картины на фоне проводимой антибактериальной терапии [2] позволил диагностировать медленно разрешающуюся пневмонию (2 группа, n=37). Пациенты с разрешением пневмонической инфильтрации до 4 недель был отнесены в 1 группу (n=52). Репрезентативность выборки оценивался по номограмме Альтмана [7], учитывая частоту генотипов (в %) в каждой группе. Также в нашей работе достигнуто соответствие равновесию Харди-Вайнберга, что позволяет переносить результаты исследования на генеральную совокупность.

Определение полиморфизма генов ФНОα G-308A, ИЛ-1β C-511T и ИЛ-10 G-1082A (n=89) проведено методом полимеразной цепной реакции на базе лаборатории «Молекулярной генетики микроорганизмов и человека» в составе Центральной научно-исследовательской лаборатории, г. Омск. Использовали олигонуклеатидные праймеры, синтезированные в институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск). Распределение частот генотипов соответствовало закону Харди-Вайнберга.

Количественные данные представлены в виде Ме (Q25; Q75), где Ме – медиана, Q25 и Q75 – верхний и нижний квартили. Описание качественных данных приводится в виде процентов с указанием числителя и знаменателя соответствующей дроби. Для оценки статистически значимых различий полученных данных использовали непараметрический Z-критерий Манна-Уитни, точный критерий Фишера, χ2, расчет отношения шансов с определением доверительного интервала. Критический уровень значимости принимался равным 0,05 [7].

Результаты исследования. Ведущими в клинической картине заболевания выступали бронхо-легочно-плевральный, интоксикационный синдромы и синдром дыхательной недостаточности. Среди пациентов с медленно разрешающимся течением заболевания отмечалось некоторое преобладание (рис. 1) лиц мужского пола (68% против 52%; р=0,140, χ2=2,18), старше 55 лет (41% против 29%; р=0,250, χ2=1,32) в сравнении с 1 группой больных.

Рис. 1. Распределение пациентов по полу и возрасту в исследуемых группах (статистически значимые отличия отсутствуют)

Рис. 1. Распределение пациентов по полу и возрасту в исследуемых группах (статистически значимые отличия отсутствуют)

Жалобы и физикальные данные были типичны для пневмонии. Сравнительный анализ клинических проявлений ВП показал, что медленно разрешающаяся пневмония достоверно чаще протекала с более выраженными клиническими симптомами (табл. 1). Наличие хотя бы одного из перечисленных признаков: повышение температуры тела ≥39 оС, увеличение частоты дыхания ≥25 в мин. и сердечных сокращений >100 в мин., снижение систолического артериального давления ≤90 мм. рт.ст. у пациентов при поступлении увеличивали вероятность развития затяжного течения в 2,5 (1-6,5) – 5,8 (1,1-30) раз (ОШ (95% ДИ)).

Таблица 1. Клиническая характеристика больных ВП при поступлении в стационар, абс. (%)

Таблица 1. Клиническая характеристика больных ВП при поступлении в стационар, абс. (%)

Примечание: здесь и далее данные представлены в виде абсолютных значений (%); статистическая значимость рассчитана с использованием критерия χ2 или точного критерия Фишера* (ЧСС – частота сердечных сокращений; АД – артериальное давление)

Оценка лабораторных проявлений воспаления показала, что в группе больных с медленно разрешающимся течением чаще наблюдалось снижение гемоглобина < 100 г/л и лейкоцитов < 4×109 в л, увеличение скорости оседания эритроцитов >40 мм/час в сравнении с 1 группой пациентов (табл. 2).

Таблица 2. Показатели общего анализа крови у больных ВП в 1-е сутки госпитализации, абс. (%)

Таблица 2. Показатели общего анализа крови у больных ВП в 1-е сутки госпитализации, абс. (%)

Примечание: СОЭ – скорость оседания эритроцитов

Наиболее частым осложнением пневмонии являлся плевральный выпот (29% больных 1 группы и 54% больных 2 группы; р=0,017, χ2=5,76). Особенностью рентгенологической картины затяжной пневмонии явилось статистически значимое увеличение доли пациентов с деструктивными изменениями в легких (19% против 2%; р=0,008).

В динамике у пациентов 2 группы наблюдались более длительные сроки нормализации температуры тела – 11 (6; 16) против 6,5 (4; 9) дней; р<0,001, Z=-3,513; и разрешения инфильтрации легочной ткани – 30 (29; 37) против 13 (11; 18) дней; р<0,001, Z=2,286; в сравнении с 1 группой больных.

Таким образом, особенностями затяжной внебольничной пневмонии явились: более выраженные клинические симптомы, анемия, лейкопения, повышение скорости оседания эритроцитов, развитие плеврального выпота и легочной деструкции. Каждый признак повышал вероятность медленного разрешения ВП от 2,5 (1-6,5) – 10,6 (2,2-51,3) раз (ОШ (95% ДИ)).

Анализ клинических особенностей у пациентов-носителей различных генотипов изучаемых полиморфизмов генов показал, что больные были сопоставимы по полу, времени обращения к врачу, сопутствующей патологии. Интенсивность воспалительного процесса у больных с генотипом GА и AA гена ФНОα-308 нашла отражение в более высоких уровнях С-реактивного белка и скорости оседания эритроцитов в периферической крови по сравнению с пациентами, несущими генотип GG (табл. 3). Наличие генотипа GA и AA ассоциировалось с затяжным течением пневмонии – 54% против 33%, по сравнению с пациентами-носителями генотипа GG (ОШ 2,42 (1,02-5,77); р=0,044; χ2=4,06). Также обращало на себя внимание развитие более тяжелого течения ВП у пациентов с генотипами GA и АA – 54% (генотип GG – 27%, ОШ 3,19 (1,31-7,78); р=0,009; χ2=6,77).

Таблица 3. Характеристика пациентов в 1-е сутки госпитализации в зависимости от полиморфизма гена ФНОα G-308A

Таблица 3. Характеристика пациентов в 1-е сутки госпитализации в зависимости от полиморфизма гена ФНОα G-308A

Примечание: здесь и далее количественные данные представлены в виде медианы (нижнего; верхнего квартилей); статистическая значимость рассчитана с использованием: # - Z-критерия Манна-Уитни для количественных признаков; для качественных – * -критерия χ2 или ** - точного критерия Фишера (ЧСС- частота сердечных сокращений; СРБ – С-реактивный белок; СОЭ – скорость оседания эритроцитов)

Тяжелое и затяжное течение заболевания у больных с различными генотипами ИЛ-1β С-511Т встречались с одинаковой частотой (38% и 41% у пациентов-носителей генотипов СТ и ТТ и 39% и 42% у носителей генотипа СС соответственно).

Изучение полиморфизма гена ИЛ-10 показало, что существовала зависимость между генотипами ИЛ-10 G-1082A и клиническими особенностями пневмонии. Были получены статистически значимые различия в частоте встречаемости плеврального выпота (31% против 53%; ОШ=0,38 (0,16-0,96); р=0,036; χ2=4,39) и затяжного течения заболевания (32% против 60%; ОШ= 0,32 (0,13-0,79); р=0,022; χ2=6,33) у пациентов с генотипами GA и AA в сравнении с больными-носителями генотипа GG. Достоверно отличались значения натрия и гемоглобина в зависимости от генотипов (табл. 4). Снижение уровня натрия является одним из критериев тяжелого течения пневмонии. По литературным данным это, предположительно, связано с гипергидратацией в ответ на гипоксию за счет повышенной выработки антидиуретического гормона [1]. Однако, различий в тяжести ВП у пациентов, несущих различные генотипы не было.

Таблица 4. Клинические и лабораторные параметры больных с внебольничной пневмонией в 1-е сутки госпитализации в зависимости от полиморфизма гена ИЛ-10 G-1082A

Таблица 4. Клинические и лабораторные параметры больных с внебольничной пневмонией в 1-е сутки госпитализации в зависимости от полиморфизма гена ИЛ-10 G-1082A

Таблица 5. Частота встречаемости генотипов ФНОα, ИЛ-1β и ИЛ-10 при различном течении ВП, абс. (%)

Таблица 5. Частота встречаемости генотипов ФНОα, ИЛ-1β и ИЛ-10 при различном течении ВП, абс. (%)

Примечание: * - р<0,05; статистическая значимость рассчитана с использованием критерия χ2.

Как видно из табл. 5, у пациентов с затяжным течением статистически значимо превалировали гомозиготы GG ИЛ-10 -1082 (49% против 23%; ОШ=3,63 (1,47-8,98); р=0,012; χ2=6,33) и генотипы GA и AA ФНОα G-308A по сравнению с обычным течением заболевания (54% против 33%; ОШ=2,84 (1,2-6,7); р=0,044; χ2=4,06).

Таким образом, среди пациентов с затяжным течением ВП чаще выявлялись генотипы GA и AA ФНОα -308 и генотип GG ИЛ-10 -1082. Проведение клинико-генетических сопоставлений показало, что группы больных достоверно отличались по выраженности клинических симптомов и лабораторных данных в зависимости от носительства отдельных генотипов.

Обсуждение результатов исследования. Исследования по изучению генетического полиморфизма у больных ВП немногочисленны. Интерес к изучению полиморфизма генов ФНОα G-308A, ИЛ-1β С-511Т и ИЛ-10 G-1082A связан с противоречивыми данными о их влиянии на характер течения и исходы пневмонии. Так, наиболее изучен при ВП полиморфизм гена ИЛ-10. Имеются данные, об увеличении риска летальности тяжелой пневмонии при наличии генотипа GG в полиморфной точке -1082 в гене данного цитокина [8-11]. Исследования о связи полиморфизма генов ФНОα и ИЛ-1β с тяжестью и исходами пневмонии носят разрозненный и противоречивый характер [4, 12-15]. Связь данных генов в развитии затяжного течения ВП не изучалась.

В нашем исследовании выявлено, что у пациентов с заменой гуанина на аденин в точке -308 гена ФНОα чаще наблюдалось тяжелое течение заболевания, в лабораторных исследованиях повышены скорость оседания эритроцитов и С-реактивный белок, что могло быть обусловлено биологическими эффектами кодируемого цитокина. Так, уровень ФНОα у носителей генотипов GA и АА повышается на 20-40% в сравнении с носителями генотипа GG [4]. ФНОα первым вырабатывается макрофагами в ответ на повреждение и инфицирование, способствует привлечению практически всех типов клеток-эффекторов воспаления и стимулирует продукцию белков острой фазы воспаления [16]. Неадекватно высокая продукция цитокина могла способствовать привлечению избытка эффекторных клеток, способствуя более тяжелому и длительному течению заболевания. Среди обследованных пациентов у носителей генотипов GA и АА статистически значимо чаще встречалось медленное разрешение пневмонии.

ИЛ-1β, также выделяясь макрофагами на первых этапах воспаления, во многом дублирует действие ФНОα. Воздействуя на гипоталамус, вызывает лихорадку, стимулирует выход нейтрофилов из костного мозга, активирует лимфоциты и нейтрофилы [16]. В нашей работе исследовалась связь клинического течения заболевания с полиморфизмом гена ИЛ-1β в локусе -511. Не обнаружено различий в частоте встречаемости тяжелой и затяжной пневмонии у пациентов, несущих различные генотипы и аллели.

Полиморфизм гена ИЛ-10 G-1082A сопровождается снижением кодируемого цитокина [8] и предрасполагает к развитию вирусных инфекций [17], в то время как тяжесть ВП и летальный исход связаны с наличием генотипа GG [9, 10, 11]. В нашем исследовании у пациентов, носителей генотипов GA и AA пневмония протекала с менее выраженными клиническими и лабораторными сдвигами. Несмотря на то, что не выявлено статистически значимых отличий в тяжести заболевания, пациенты, гомозитотные по аллелю G отличались более выраженной интоксикацией в начале заболевания (выше показатели температуры тела и частоты сердечных сокращений), в анализах крови снижены уровни гемоглобина и натрия, чаще развивался плевральный выпот в сравнении с носителями аллеля А. Неадекватно высокий уровень цитокина в ответ на бактериальные стимулы у пациентов с генотипом GG уже в начале заболевания мог приводить к подавлению воспаления, так необходимого на первых этапах, и тем самым способствовать размножению микроорганизмов и усугубляющему действию токсинов на ткани [16], что приводило к более выраженным клиническим и лабораторным проявлениям. Одним из эффектов ИЛ-10 является подавление регенерации и репарации тканей [16], что могло, наряду с массивным проникновением микроорганизмов, приводить к более длительным срокам разрешения инфильтрации легочной ткани. Чаще затяжная пневмония наблюдалась у пациентов с генотипом GG.

Таким образом, медленное разрешение ВП ассоциировалось с «высокопродуцирующими» вариантами генотипов ФНОα G-308A и ИЛ-10 G-1082A.

Выводы

1. Характер течения воспалительного процесса при внебольничной пневмонии ассоциировался с полиморфизмом гена ИЛ-10 G-1082А и ФНОα G-308A, что находило отражение в склонности к более тяжелому и осложненному течению заболевания, а также в длительности сохранения клинических симптомов и разрешения инфильтрации легочной ткани у лиц, несущих генотип GG ИЛ-10 и генотипы GA и AA ФНОα.

2. Полиморфизм гена ИЛ-1β не был связан с тяжелым и затяжным течением ВП.

3. Наличие генотипов GA и AA ФНОα -308 и генотипа GG ИЛ-10 -1082 у больных ВП повышает вероятность развития затяжного течения.


Список использованных источников:

1. Чучалин А.Г. Внебольничная пневмония у взрослых: практические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике. - М., 2010. 107 с.

2. Синопальников А.И., Зайцев А.А. «Трудная» пневмония. - М., 2010. 56 с.

3. Симбирцев А.С., Громова А.Ю. Функциональный полиморфизм генов регуляторных молекул воспаления// Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 1. С. 3-10.

4. Ривзанова Ф.Ф., Пикуза О.И. Генетическая диагностика: полиморфизм генов цитокинов// Практическая медицина. 2010. №45. С. 41-43.

5. Пальцев М.А. Введение в молекулярную диагностику. - М: Медицина, 2011. Т. 2. 503 с.

6. Покровский В.И., Брико Н.Т. Общая эпидемиология с основами доказательной медицины. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. 400 с.

7. Петри А. Наглядная медицинская статистика. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. 168 с.

8. Iyer S.S., Cheng G. Role of Interleukin 10 Transcriptional Regulation in Inflammation and Autoimmune Disease// Сritical reviews in immunology. 2012. Vol. 32, N. 1. P. 23–63.

9. Gallagher P.M., Lowe G., Fitzgerald T. et al. Association of IL-10 polymorphism with severity of illness in community acquired pneumonia// Thorax. 2003. Vol. 58, № 2. P. 154-156.

10. Shaaf B. M.,Boehmke F., Esnaashari H. et al. Pneumococcal septic shock is associated with the interleukin-10-1082 gene promoter polymorphism// American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 2003. Vol. 168, № 4. P. 476-480.

11. Wattanathum A., Manocha S., Groshaus H. et al .Interleukin-10 Haplotype Associated With Increased Mortality in critically Ill Patients With Sepsis From Pneumonia But Not in patients With Extrapulmonary Sepsis// Chest. 2005. Vol. 128, № 3. P. 1690-1698.

12. Байгозина Е. А. Клинико-патофизиологические аспекты диагностики и прогнозирования исхода нозокомиальной пневмонии: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. - Омск, 2011.

13. Qidway T. Tumour necrosis factor gene polymorphism and disease prevalence// Scandinavian Journal of Immunology. 2011. Vol. 74, №6. Р. 522-547.

14. Li L., Nie W., Li W. et al. Associations between TNFα polymorphisms and pneumonia// PLoS One. 2013. Vol. 8, №4. e61039.

15. Сабитова О.Н., Совалкин В.И. Полиморфизм генов и продукция основных иммунорегуляторных цитокинов при внебольничной пневмонии// Омский научный вестник. 2009. №1 (84). С. 42-45.

16. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. – СПб.: Фолиант, 2008. 552 с.

17. Samanta M., Iwakiri D., Takada K. Epstein-Barr virus-encoded small RNA induced IL-10 through RIG-I-mediated IRF-3 signaling// Oncogene. 2008. Vol. 27, № 30. P. 4150-4160.


19.10.2013 16:15:00